Bacteriófagos en el procesamiento de alimentos
“Las enfermedades transmitidas por alimentos siguen siendo una de las principales causas de hospitalización y muerte en todo el mundo, a pesar de los numerosos avances en la higiene alimentaria y la vigilancia de patógenos. Los métodos antimicrobianos convencionales, como la pasteurización, el procesamiento a alta presión, la irradiación y los desinfectantes químicos, pueden reducir las poblaciones microbianas en los alimentos en diversos grados, pero también presentan desventajas significativas, como una alta inversión inicial y un posible daño a los equipos de procesamiento debido a su naturaleza corrosiva y un efecto perjudicial sobre las propiedades organolépticas (y posiblemente el valor nutricional) de los alimentos. Quizás lo más importante es que estas estrategias de descontaminación eliminan indiscriminadamente, incluyendo muchas bacterias –a menudo beneficiosas– que están presentes de forma natural en los alimentos.Una técnica prometedora que aborda varias de estas deficiencias es el biocontrol con bacteriófagos, un método natural y respetuoso con el medio ambiente en el que los bacteriófagos líticos aislados del entorno se dirigen específicamente a las bacterias patógenas y las eliminan (o reducen significativamente su contenido) de los alimentos. Desde la primera idea de utilizar bacteriófagos en los alimentos, numerosos informes de investigación han descrito el uso del biocontrol con bacteriófagos para combatir una amplia variedad de patógenos bacterianos en diversos alimentos, desde carnes frías listas para consumir hasta frutas y verduras frescas. El número de productos disponibles comercialmente que contienen bacteriófagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria también ha aumentado constantemente.Aunque aún persisten algunos desafíos, el biocontrol con bacteriófagos es cada vez más reconocido como una modalidad atractiva en nuestro arsenal de herramientas para eliminar de forma segura y natural las bacterias patógenas de los alimentos.
1. Introducción
Desde las hojas de lechuga hasta el queso cheddar en una ensalada Cobb, pasando por las comidas preparadas congeladas, los alimentos que consumimos están expuestos a un riesgo constante de contaminación por patógenos microbianos que posteriormente pueden transmitirse al consumidor. Recientemente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció el Grupo de Referencia para la Epidemiología de las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (FERG) para monitorear las enfermedades transmitidas por alimentos a nivel mundial. El FERG monitoreó los 31 patógenos transmitidos por alimentos que causaron la mayor morbilidad y mortalidad en humanos. En su estimación más reciente (2015) de la carga global de enfermedades causadas por alimentos, el FERG estimó que en 2010 ocurrieron 600 millones de infecciones transmitidas por alimentos, causando más de 400.000 muertes. Entre los cinco microorganismos más comunes que causan enfermedades transmitidas por alimentos, cuatro eran bacterias: Escherichia coli (~ 111 millones), Campylobacter spp. (~ 96 millones), Salmonella enterica no tifoidea (~ 78 millones) y Shigella spp. (~ 51 millones), con el número de muertes transmitidas por alimentos causadas por estas bacterias estimadas en ~ 15.000 para Shigella spp. hasta ~ 63.000 para E. coli [ 1 ]. Fue notable que los niños menores de cinco años se vieron afectados de manera desproporcionada; son responsables del 40% de las muertes y representan solo el 9% de la población mundial [ 1 ]. Estas enfermedades transmitidas por alimentos también imponen una enorme carga a las economías nacionales. En los Estados Unidos, por ejemplo, el incidente promedio se estima en aproximadamente 1500 USD por persona, con un costo anual total estimado de estas enfermedades transmitidas por alimentos que supera los 75 mil millones de USD [ 2 ].
Existen varios enfoques para mejorar la seguridad de nuestros alimentos. La pasteurización por calor se utiliza comúnmente para reducir el recuento bacteriano en líquidos y productos lácteos, especialmente la leche. Sin embargo, la pasteurización no es adecuada para muchos alimentos frescos, ya que el proceso hace que los productos se cocinen. Otro método para reducir los patógenos en los alimentos es el procesamiento a alta presión (HPP), que somete los alimentos a alta presión para inactivar los microbios. Esta técnica se ha aplicado con éxito a productos líquidos y comidas precocinadas destinadas a la congelación. Sin embargo, al igual que la pasteurización por calor, generalmente no se utiliza en carnes y productos frescos, ya que puede afectar la apariencia (color) y/o el contenido nutricional de estos productos [ 3 , 4 ]. La irradiación también es un medio eficaz para reducir la carga de organismos patógenos en los alimentos. Sin embargo, la irradiación puede afectar negativamente las propiedades organolépticas de los alimentos. Además, la aceptación de este método por parte de los clientes es baja y se agrava por la obligación de etiquetar muchos alimentos tratados con radiación [ 5 , 6 ]. Finalmente, los desinfectantes químicos como el cloro y el ácido peracético (PAA) se utilizan comúnmente para reducir la contaminación microbiana de muchas frutas y verduras frescas, así como de productos alimenticios listos para consumir (RTE) [ 7 , 8 ]. Aunque generalmente son eficaces, muchos de estos productos químicos son corrosivos y pueden dañar los equipos de procesamiento de alimentos. Los desinfectantes químicos también pueden tener un impacto ambiental adverso (es decir, no son respetuosos con el medio ambiente), y dadas las tendencias actuales hacia los alimentos orgánicos sin químicos, la aceptación de los aditivos químicos en los alimentos (especialmente en los productos frescos) por parte de los consumidores está disminuyendo rápidamente. Una desventaja común de todas estas técnicas es que eliminan los microbios indiscriminadamente. en otras palabras, tanto los patógenos como las bacterias de la flora normal potencialmente beneficiosas se ven igualmente afectados. Además, a pesar de la multitud de métodos disponibles, los brotes de enfermedades transmitidas por alimentos siguen siendo relativamente comunes.Estos factores combinados ilustran la necesidad de un enfoque antimicrobiano dirigido que pueda usarse solo o en combinación con las técnicas descritas anteriormente para crear barreras adicionales en un enfoque de múltiples obstáculos para evitar que los patógenos bacterianos transmitidos por los alimentos lleguen a los consumidores. Una de estas técnicas es el uso de bacteriófagos líticos para atacar bacterias específicas transmitidas por los alimentos en nuestros alimentos sin afectar negativamente su microflora normal, y a menudo beneficiosa. Este enfoque se conoce como “biocontrol con bacteriófagos” o “biocontrol con fagos”.
El biocontrol con fagos es cada vez más aceptado como una tecnología natural y respetuosa con el medio ambiente que puede dirigirse específicamente a patógenos bacterianos en diversos alimentos para proteger la cadena alimentaria ( Tabla 1 ). Los bacteriófagos fueron identificados por primera vez en 1917 por Felix d’Herelle, y la utilidad de estos “comedores de bacterias” para combatir enfermedades bacterianas fue rápidamente aprovechada [ 9 ].En el contexto de la seguridad alimentaria, los bacteriófagos abordan muchas de las preocupaciones de los consumidores. Por ejemplo, debido a la especificidad de los bacteriófagos, el biocontrol con fagos ofrece una oportunidad única para dirigirse a las bacterias patógenas en los alimentos sin alterar la microflora normal de los alimentos. Cabe destacar que el ejército de los EE. UU. inició recientemente un proyecto (W911QY-18-C-0010) para investigar más a fondo los efectos de la aplicación de fagos en comparación con los antibióticos químicos convencionales sobre la microbiota normal de los productos frescos y los posibles impactos de estas medidas en el valor nutricional de los alimentos. Además, el biocontrol con fagos es probablemente la intervención antimicrobiana más respetuosa con el medio ambiente disponible actualmente. La mayoría, si no todos, los productos comerciales de biocontrol con fagos disponibles actualmente contienen fagos naturales, es decir, fagos aislados del medio ambiente que no están modificados genéticamente. Muchas de estas preparaciones tampoco contienen aditivos ni conservantes; típicamente son soluciones acuosas que consisten en fagos purificados y pequeñas cantidades de sales. Algunas preparaciones de fagos disponibles en el mercado también están certificadas como kosher y halal y están disponibles para su uso en alimentos orgánicos (listadas por OMRI en los EE. UU.; SKAL en la UE) ( Tabla 2 ). Aunque las pruebas son limitadas, el trabajo de nuestro grupo sugiere que los bacteriófagos no alteran las propiedades organolépticas (es decir, sensoriales) de los alimentos [ 10 ]. En comparación con otras medidas de seguridad alimentaria, el coste de aplicar bacteriófagos es relativamente bajo, generalmente en el rango de 1 a 4 céntimos por libra de alimento tratado. El tratamiento y la irradiación con HPP suelen costar de 10 a 30 céntimos por libra [ 11 ]. Es importante señalar que estas cifras representan solo el coste de cada intervención y no tienen en cuenta situaciones en las que un enfoque de múltiples obstáculos puede ser necesario por razones de seguridad alimentaria (por ejemplo, se teme que los alimentos estén contaminados por más de un patógeno transmitido por los alimentos) o por razones de seguridad alimentaria (por ejemplo, deterioro de los alimentos, que suele ser causado por varios microorganismos diferentes).
Las propiedades biológicas de los bacteriófagos líticos y otras características de los productos comerciales de biocontrol con fagos, como se explicó anteriormente, hacen del biocontrol con fagos un método muy atractivo para mejorar aún más la seguridad de nuestros alimentos, y un número creciente de empresas en todo el mundo se dedican a su desarrollo y comercialización [ 12 ] ( Tabla 2 ). Sin embargo, el biocontrol con fagos tiene sus limitaciones y desventajas. Por ejemplo, las preparaciones de fagos requieren almacenamiento refrigerado (generalmente 2–8 °C) y pueden necesitar aplicarse por separado de los desinfectantes químicos, ya que los productos químicos agresivos también pueden inactivar las partículas de fagos y hacer que el biocontrol con fagos sea menos eficaz. Debido a su alta especificidad natural, las preparaciones de fagos pueden combatir eficazmente los patógenos en los alimentos de forma dirigida. Sin embargo, si los alimentos están accidentalmente contaminados con dos o más patógenos bacterianos transmitidos por los alimentos, una preparación de fagos dirigida a un solo patógeno no será eficaz para eliminar los patógenos no objetivo de los alimentos. Como última consideración, se debe tener cuidado de usar fagos líticos y excluir los fagos templados de las preparaciones de bacteriófagos. Los fagos templados suelen ser menos eficaces para matar a sus huéspedes bacterianos que los fagos líticos. Además, los fagos templados pueden integrar su ADN en el cromosoma bacteriano y, por lo tanto, pueden promover la transferencia de genes de virulencia u otros genes indeseables (por ejemplo, genes que codifican la resistencia a antibióticos) entre cepas bacterianas, lo que podría conducir a la aparición de nuevas cepas patógenas. El riesgo de tal aparición es significativamente menor cuando se utilizan fagos líticos.
Esta revisión se centra en las aplicaciones de bacteriófagos de tipo salvaje para mejorar la seguridad alimentaria. No discutimos otros posibles métodos relacionados con los fagos, como el uso de endolisinas de fagos para combatir patógenos transmitidos por los alimentos o el uso de bacteriófagos para combatir el deterioro de los alimentos. Estos temas ya han sido discutidos por otros autores y hay revisiones relevantes disponibles [ 13 , 14 ].En el contexto de las aplicaciones de seguridad alimentaria, los bacteriófagos líticos de tipo salvaje pueden utilizarse tanto antes de la cosecha (por ejemplo, en animales vivos, administrados a través de piensos o rociados antes del sacrificio) como/o después de la cosecha (por ejemplo, aplicados directamente a las superficies de los alimentos, ya sea mediante pulverización directa, a través de materiales de envasado o de otras formas) para reducir la contaminación por bacterias patógenas [ 12 , 15 ]. El biocontrol con bacteriófagos también podría ser un medio para desinfectar las superficies utilizadas en la producción y procesamiento de alimentos [ 16 , 17 ]. En revisiones anteriores [ 12 , 14 , 18 , 19 ], nosotros y otros hemos compilado una visión general de las industrias y productos en los que se utilizan bacteriófagos en aplicaciones de seguridad alimentaria. Aquí, proporcionamos una visión general actualizada (y una tabla de resumen ampliada) que describe estudios en los que los bacteriófagos se han aplicado predominantemente a alimentos poscosecha, en particular carne, productos frescos y alimentos RTE ( Tabla 1 ). En la siguiente sección, se discutirán estudios seleccionados de los últimos cinco años en los que se utilizó el biocontrol con bacteriófagos para combatir cuatro patógenos importantes transmitidos por los alimentos. Finalmente, también discutimos la regulación de los bacteriófagos para aplicaciones en seguridad alimentaria y algunos de los desafíos del biocontrol con fagos.
2. Biocontrol con fagos para combatir los patógenos bacterianos más comunes transmitidos por los alimentos
2.1. Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes es un bacilo grampositivo, anaerobio facultativo. El consumo de alimentos contaminados con L. monocytogenes causa una serie de síntomas en humanos, como síntomas iniciales similares a la gripe o gastrointestinales, que en algunos casos pueden llevar a encefalitis o síntomas cervicales y, posiblemente, a un aborto espontáneo en madres embarazadas. Se estima que en 2010 hubo más de 14.000 casos de infecciones transmitidas por alimentos por L. monocytogenes en todo el mundo, causando más de 3000 muertes [ 1 ]. L. monocytogenes puede sobrevivir y crecer a temperaturas refrigeradas (2–8 °C), que se utilizan comúnmente en la distribución y almacenamiento de muchos alimentos. Por lo tanto, la detección y eliminación de L. monocytogenes es crucial para garantizar la seguridad de la cadena alimentaria, especialmente en los alimentos RTE. En este contexto, varios investigadores han demostrado que la aplicación de bacteriófagos a diversos alimentos (incluidos los alimentos RTE) reduce eficazmente la contaminación por L. monocytogenes ( Tabla 1 ). Por ejemplo, se ha informado que una preparación de monofago comercial (es decir, una preparación de fago que consiste en un solo fago) dirigida a Listeria reduce eficazmente los niveles de L. monocytogenes en lonchas de jamón y es superior al lactato-nisina y al sodio a la temperatura de abuso de almacenamiento de 6–8 °C [ 47 ]. Un estudio similar de Chibeu y colegas (2013) demostró que la misma preparación de monofago también podía reducir L. monocytogenes en la superficie de otras carnes frías [ 44 ]. La carne (pavo y rosbif cocidos en lonchas) se almacenó a 4 °C y a una temperatura de abuso de 10 °C. El fago específico de Listeria fue eficaz contra L. monocytogenes cuando se usó solo, y aumentó la eficacia de otros agentes antimicrobianos cuando se usó junto con diacetato de sodio o lactato de potasio. Todos estos estudios utilizaron una única preparación de fagos. Un cóctel de fagos preparado con múltiples bacteriófagos puede ser superior a una única preparación de fagos, tanto en términos de una cobertura más amplia de las especies objetivo como de una reducción del riesgo de aparición de bacterias resistentes. Un cóctel de seis fagos de este tipo disponible comercialmente contra L. monocytogenes se probó en una serie de alimentos contaminados experimentalmente con L. monocytogenes , incluyendo lechuga, queso duro pasteurizado, salmón ahumado y rodajas de manzana Gala; la aplicación de este cóctel de bacteriófagos redujo los niveles de L. monocytogenes en todos estos alimentos en ~ 0,7–1,1 logs [ 10 ]. El mismo estudio investigó la aplicación del cóctel específico de L. monocytogenes a comidas precocinadas congeladas y preenvasadas. Las comidas se contaminaron experimentalmente con L. monocytogenes , se trataron con el cóctel de fagos y se sometieron a ciclos de congelación y descongelación. Los resultados mostraron una reducción de L. monocytogenes de 2,2 log, lo que sugiere que el biocontrol con fagos puede ser un medio eficaz para controlar L. monocytogenes en los alimentos en condiciones de “abuso de almacenamiento”, cuando las comidas congeladas se descongelan intencional o involuntariamente varias veces durante su almacenamiento [ 10 ].
En muchos de los estudios discutidos anteriormente, a pesar de la reducción inicial significativa de los niveles de L. monocytogenes en los alimentos, las poblaciones bacterianas objetivo no fueron completamente erradicadas, y aún se pudieron recuperar células viables de L. monocytogenes , aunque en un número mucho menor. Sin embargo, las preparaciones de bacteriófagos seguían siendo eficaces contra colonias seleccionadas al azar de las bacterias recuperadas, lo que sugiere que la resistencia a los fagos no fue la razón principal de la erradicación incompleta de L. monocytogenes [ 23 , 37 , 44 ]. Existen varias explicaciones posibles para esta observación. Por ejemplo, las células de L. monocytogenes podrían exhibir una resistencia temporal a la infección por fagos, como se ha informado anteriormente [ 70 , 71 ]. Otra posible explicación es que, después de rociar los fagos sobre los alimentos (por ejemplo, debido al uso de un volumen de pulverización demasiado bajo, especialmente en alimentos con topografía compleja), los fagos no entraron en contacto directo con algunas células de L. monocytogenes , lo que resultó en que estas células bacterianas no fueran lisadas por los fagos. En este último escenario, el uso de mayores volúmenes de pulverización, pulverizaciones finas (tipo niebla), alimentos rotatorios/giratorios durante la aplicación de fagos y la garantía de una cobertura completa de la superficie con fagos pueden ayudar a mejorar la eficacia del biocontrol con fagos.
2.2. Salmonella spp.
Los serotipos no tifoideos de Salmonella enterica son responsables de muchos casos de gastroenteritis en todo el mundo cada año. La enfermedad causada por estas bacterias gramnegativas en forma de bastón suele ser autolimitada y presenta síntomas como calambres abdominales, fiebre, náuseas y diarrea. Sin embargo, pueden ocurrir casos potencialmente mortales en los que las bacterias se deshidratan e invaden el tracto gastrointestinal.Se estima que en 2010 se produjeron más de 78 millones de casos de infecciones transmitidas por alimentos por Salmonella en todo el mundo, lo que resultó en casi 60.000 muertes [ 1 ]. Durante el procesamiento y envasado de alimentos, Salmonella y otros patógenos pueden adherirse y contaminar las superficies donde se preparan los alimentos. Estos factores exponen a los alimentos RTE, como frutas y verduras frescas que no se han cocinado antes de su consumo, a un riesgo particularmente alto de transmitir patógenos bacterianos y causar intoxicaciones alimentarias.
Actualmente, hay al menos dos preparaciones de fagos aprobadas por la FDA contra Salmonella en el mercado ( Tabla 2 ). Hay varias publicaciones disponibles que describen sus aplicaciones (y las de otras preparaciones de fagos no comerciales) en diversos alimentos. En la Tabla 1 se incluyen breves resúmenes de estos estudios. Un estudio es de particular interés, ya que demuestra un ejemplo de cómo se puede manejar la resistencia a los fagos cuando compromete la eficacia de una preparación de bacteriófagos. En este estudio, se investigó un cóctel de seis fagos contra Salmonella , clasificado como GRAS (generalmente reconocido como seguro), por su capacidad para reducir los niveles de Salmonella en superficies similares a las que se encuentran comúnmente en las plantas de procesamiento de alimentos, como el acero inoxidable y el vidrio [ 16 ]. Los estudios iniciales mostraron que el cóctel de bacteriófagos específico de Salmonella redujo significativamente la población de cepas de Salmonella susceptibles en todas las superficies examinadas en ~ 2–4 cepas; al mismo tiempo, fue ineficaz para reducir los niveles de otra cepa de Salmonella ( Salmonella Paratyphi B S661) que era resistente al cóctel de fagos in vitro [ 16 ]. Sin embargo, cuando el cóctel de fagos se ajustó para incluir fagos que se dirigían específicamente a esta cepa resistente, la preparación actualizada mostró una reducción significativa (~ 2 log) de S. Paratyphi B S661 de las superficies, al tiempo que mantuvo la eficacia contra los aislados previamente susceptibles [ 16 ]. Este estudio proporciona pruebas convincentes de que los cócteles de fagos pueden modificarse fácilmente para dirigirse a cepas bacterianas específicas, por ejemplo, cuando surgen mutantes resistentes a los fagos, o para dirigirse específicamente a las cepas problemáticas predominantes en determinadas plantas de fabricación de alimentos.
Además de su utilidad en la descontaminación de superficies para la preparación de alimentos, los cócteles de bacteriófagos también han eliminado Salmonella directamente de los alimentos. Por ejemplo, el mismo cóctel específico de Salmonella discutido anteriormente redujo los niveles de Salmonella en piezas de pollo contaminadas experimentalmente cuando se aplicó solo, y este efecto se potenció cuando el fago se aplicó en combinación con desinfectantes químicos convencionales [ 59 ]. En filetes de pechuga de pollo, el cóctel de bacteriófagos redujo significativamente el número de una mezcla de especies de Salmonella cuando se aplicó a la superficie de los filetes o cuando los filetes se sumergieron en un recipiente que contenía la solución de fagos [ 60 ]. Además, este cóctel de fagos redujo significativamente el número de Salmonella cuando los filetes se almacenaron en condiciones aeróbicas o de atmósfera modificada [ 60 ]. Este último hallazgo puede tener implicaciones prácticas directas, ya que los fabricantes de alimentos suelen utilizar condiciones de atmósfera modificada para inhibir el crecimiento bacteriano y prolongar la vida útil de los alimentos. Otro estudio encontró que un solo fago, SJ2, redujo significativamente la cantidad de Salmonella en huevo líquido y carne de cerdo picada, y esta reducción fue más pronunciada a temperaturas más altas [ 62 ]. Los autores examinaron las colonias de Salmonella restantes en busca de resistencia; mientras que no hubo diferencia en el número de clones resistentes de muestras de carne de cerdo picada tratadas con fagos y no tratadas, se encontró un número significativamente mayor de clones resistentes en las muestras de huevo líquido tratadas con fagos [ 62 ]. Los autores sugirieron que tanto la matriz alimentaria (sólida y líquida) como las diferencias en el microbioma de los dos alimentos podrían haber contribuido a esta diferencia en el número de aislados de Salmonella resistentes [ 62 ].
Las enfermedades transmitidas por alimentos causadas por serotipos no tifoideos de Salmonella también representan un riesgo para la salud de las mascotas (por ejemplo, perros y gatos), y la estrecha conexión de estos animales con sus dueños aumenta la posibilidad de enfermedades en humanos. De hecho, el brote de Salmonella en humanos se ha relacionado con alimentos contaminados para gatos y perros, y se encontró que aproximadamente un tercio de los alimentos crudos y naturales comerciales incluidos en la muestra contenían Salmonella [ 72 , 73 ]. Para contrarrestar este riesgo para la salud, recientemente se ha investigado el biocontrol con fagos como una técnica para reducir o eliminar Salmonella en alimentos para mascotas. Se encontró que el cóctel de seis fagos específico de Salmonella discutido anteriormente redujo los niveles de Salmonella en alimentos secos para perros contaminados experimentalmente en 1 log [ 74 ]; cuando se alimentó a gatos y perros con pienso seco tratado con el mismo cóctel de fagos, pareció ser seguro y no tuvo un impacto perceptible en ninguna de las métricas clave de salud registradas para ninguno de los animales [ 61 ].
Una alternativa al pienso seco que está ganando popularidad es la comida cruda. Estas comidas para mascotas consisten en carne como pollo, pato o atún, combinada con verduras, incluyendo lechuga, arándanos y brócoli, que se vende y se sirve cruda [ 61 ]. La comida cruda para mascotas está ganando popularidad debido a sus excelentes valores nutricionales. Al mismo tiempo, dado que no están cocinadas, existe una mayor probabilidad de que contengan patógenos transmitidos por los alimentos que pueden transmitirse tanto a las mascotas como a los consumidores desprevenidos durante el proceso de alimentación.Recientemente, se publicó al menos un informe en el que los autores investigaron el valor del uso de fagos para combatir Salmonella en ingredientes crudos para alimentos para mascotas. La reducción de la contaminación bacteriana osciló entre 0,4 log y 1,1 log, la eficacia dependía de la concentración y la mayor reducción se logró cuando se utilizaron altas dosis de la preparación de bacteriófagos [ 61 ] ( Tabla 1 ).
2.3. Escherichia coli
Muchas cepas de la bacteria gramnegativa en forma de bastón Escherichia coli se encuentran naturalmente en el intestino humano y son beneficiosas para nuestra salud y bienestar. Por ejemplo, ayudan en la digestión de los alimentos y en el mantenimiento de un sistema inmunológico robusto. Sin embargo, algunas cepas de E. coli pueden causar y causan enfermedades en humanos. Por ejemplo, la toxina Shiga, que produce E. coli serotipo O157:H7 y que a veces se encuentra en agua contaminada o en alimentos, especialmente carne de res, puede ingresar al tracto gastrointestinal humano y causar una enfermedad, con síntomas como calambres abdominales y diarrea hemorrágica. Estas infecciones suelen ser autolimitadas en individuos inmunocompetentes, pero pueden ser potencialmente mortales en pacientes muy jóvenes o ancianos. Se ha estimado que más de un millón de casos de enfermedades transmitidas por alimentos y más de cien muertes en todo el mundo se deben a E. coli productora de toxina Shiga, incluido el serotipo O157:H7 [ 1 ].
Trabajos recientes han demostrado que las preparaciones de fagos específicos de E. coli fueron eficaces en el tratamiento de verduras frescas [ 75 ] y tanto leche cruda como tratada con ultra alta temperatura (UHT) contaminada con E. coli [ 33 ]. En el primer estudio, los niveles de E. coli O157:H7 en rodajas de pimiento verde y hojas de espinaca se redujeron en aproximadamente 1–4 log mediante un solo fago, y la reducción inicial se mantuvo a 4 °C, mientras que se observó cierto rebrote a 25 °C. En el segundo estudio, las concentraciones de E. coli tanto en leche UHT como en leche cruda se redujeron a niveles indetectables cuando se utilizó un cóctel de dos o tres fagos. Notablemente, esta reducción se mantuvo en todas las muestras tratadas con la preparación de tres fagos durante el almacenamiento tanto a 4 como a 25 °C; en contraste, la cepa de E. coli volvió a crecer en las muestras tratadas con el cóctel de dos fagos. Aunque las razones subyacentes no se han dilucidado completamente, es posible que el cóctel de tres fagos ofrezca un mejor control de la resistencia que un cóctel de dos fagos, y la eficacia mejorada de los cócteles de múltiples fagos ya se ha demostrado para otras preparaciones de fagos [ 76 ]. Aunque las razones subyacentes de este fenómeno no se han determinado con exactitud, es posible que la presencia de múltiples fagos en un cóctel de fagos reduzca el riesgo de aparición de mutantes resistentes a los fagos, ya que se requerirían múltiples mutaciones para que una célula bacteriana específica se volviera resistente no a uno, sino a varios fagos del cóctel, suponiendo que los fagos se dirijan a diferentes estructuras celulares. Este concepto es esencialmente análogo al enfoque de múltiples obstáculos, en el que se propone una combinación de estrategias antibacterianas para prevenir el desarrollo de resistencia bacteriana [ 77 ]. Estos y algunos estudios adicionales que utilizan fagos específicos de E. coli en aplicaciones de seguridad alimentaria se resumen brevemente en la Tabla 1 .
2.4. Shigella spp.
Las especies del género bacteriano gramnegativo en forma de bastón Shigella causan una infección gastrointestinal autolimitada con síntomas como diarrea hemorrágica y dolor abdominal. A nivel mundial, la incidencia de infecciones transmitidas por alimentos causadas por Shigella se estimó en más de 50 millones en 2010, lo que resultó en más de 15.000 muertes [ 1 ]. La gran mayoría de estas infecciones ocurrieron en países en desarrollo, con la mayoría de las infecciones y muertes en niños menores de 5 años [ 1 , 78 ].
Actualmente, solo hay una preparación de fagos aprobada por la FDA para la seguridad alimentaria contra Shigella spp. disponible. [ 66 , 69 ]. Este cóctel de cinco fagos obtuvo el estatus GRAS (GRN 672) en 2017 ( Tabla 2 ), y se demostró que reducía los niveles de Shigella en una variedad de alimentos, incluyendo melones, lechuga, yogur, carne enlatada, salmón ahumado y pechuga de pollo, en aproximadamente 1 log [ 66 ]. En otro estudio, se utilizó el mismo cóctel de bacteriófagos específico de Shigella para comparar la seguridad y eficacia de la administración de fagos con el tratamiento antibiótico en ratones expuestos a una cepa de Shigella sonnei [ 69 ]. Este estudio demostró que, aunque el cóctel de bacteriófagos específico de Shigella fue tan eficaz como un tratamiento antibiótico estándar para reducir la carga bacteriana en ratones, el tratamiento con el antibiótico alteró significativamente la diversidad de la comunidad intestinal del ratón, mientras que la administración de fagos tuvo un impacto mucho menor en la microbiota intestinal normal de los ratones en comparación con el tratamiento antibiótico [ 69 ]. Los autores no observaron efectos secundarios perjudiciales en los ratones tras la administración de fagos, es decir, el fago no alteró ni la composición de la sangre o la orina de los ratones ni tuvo un efecto adverso sobre la morbilidad o mortalidad, el peso u otros parámetros fisiológicos de los animales [69]. Aunque estos bacteriófagos no son directamente relevantes para aplicaciones en el ámbito de la seguridad alimentaria, el estudio reveló que, al administrarse por vía oral (imitando un escenario en el que se consumirían al ingerir alimentos tratados con ellos), no afectan a la flora intestinal normal (a diferencia de los antibióticos) y no provocaron efectos secundarios en ninguno de los animales examinados.
2.5. Campylobacter jejuni
Campylobacter spp., bacterias gramnegativas con forma de bastón, son los principales patógenos de origen alimentario en humanos y causan síntomas gastrointestinales que pueden incluir dolor abdominal, fiebre y diarrea. En un informe reciente (2015), el FERG estimó que en 2010 los casos mundiales causados por Campylobacter spp. superaron los 95 millones y provocaron más de 21.000 muertes [1]. La flora intestinal de muchas aves de corral y otros animales de granja contiene especies de Campylobacter. Aunque la vía de entrada no está completamente aclarada, Campylobacter puede aislarse con frecuencia tanto de la superficie como del interior del hígado de pollo. Las infecciones zoonóticas se producen habitualmente en humanos cuando se manipulan o consumen productos animales contaminados, como carne. Por lo tanto, existe un mayor riesgo de infección por Campylobacter para las personas cuando se preparan elaboraciones mínimamente cocinadas, como el paté.
Se han aislado varios bacteriófagos de Campylobacter de pollos, incluidas las heces, así como de la superficie y el tejido interno del hígado de pollo, y algunos de ellos se han estudiado por su capacidad para reducir la contaminación por Campylobacter en diversos alimentos [79, 80, 81, 82]. Por ejemplo, Hammerl y colaboradores [80] utilizaron los fagos como tratamiento previo a la cosecha y demostraron una reducción significativa (~3 log) de los recuentos fecales de Campylobacter cuando pollos de 20 días de edad fueron tratados secuencialmente con dos fagos (un fago del grupo III, seguido de un fago del grupo II). Curiosamente, la dosificación del fago del grupo III solo o en combinación con otro fago del grupo III no fue eficaz, lo que sugiere que se requería una combinación de diferentes fagos (grupos II y III) para una eficacia óptima. El aislamiento de fagos específicos de Campylobacter se ha realizado históricamente con un número limitado de aislados de Campylobacter, utilizando en muchos estudios solo un aislado de C. jejuni NCTC 12662 como cepa huésped para el aislamiento de fagos. Los fagos aislados con esta única cepa son casi exclusivamente fagos del grupo III, que se dirigen a un receptor específico, el polisacárido capsular [83]. Por el contrario, los fagos aislados en C. jejuni RM1221 son típicamente fagos del grupo II, que utilizan los flagelos como vía de entrada [83]. Como se desprende del estudio anterior [80], un cóctel de fagos compuesto por fagos que se dirigen a diferentes receptores podría conducir potencialmente a un rango de acción más amplio y cócteles más eficaces.
3. Preparados de bacteriófagos como productos comerciales
3.1. Regulación de preparados de bacteriófagos
En los últimos aproximadamente 12 años, el número de autorizaciones regulatorias para preparados de bacteriófagos y su uso para mejorar la seguridad alimentaria ha aumentado constantemente (Tabla 2). En 2006, la FDA otorgó la primera autorización para un preparado de bacteriófagos para uso directo en el suministro de alimentos para el cóctel específico de L. monocytogenes ListShield™ como aditivo alimentario (la FDA no «aprueba» productos basados en fagos o de otro tipo; sin embargo, el término «autorización» se utiliza habitualmente para indicar la obtención del permiso de la FDA para el uso de productos en las aplicaciones previstas). Más adelante ese mismo año, la FDA publicó una carta de no objeción para el preparado específico de Listeria Listex™ (actualmente PhageGuard Listex™) como sustancia generalmente reconocida como segura (GRAS). En los últimos años, la FDA ha otorgado la autorización GRAS a varios productos de fagos (por ejemplo, SalmoFresh™ y PhageGuard S™). Solicitar la autorización GRAS parece ser ahora la vía de autorización estándar para productos de fagos destinados al tratamiento de alimentos poscosecha. Dado que los bacteriófagos líticos de tipo salvaje (es decir, no modificados genéticamente) son completamente naturales y ya están presentes en el suministro de alimentos, la designación GRAS parece ser una vía regulatoria apropiada para tales preparados. Además, el USDA ha incluido varios preparados de fagos en sus directrices publicadas sobre ingredientes seguros y adecuados para la producción de productos cárnicos, avícolas y de huevo. Por ejemplo, según la directriz FSIS 7120.1, está permitida la aplicación de fagos en animales de granja antes del sacrificio (por ejemplo, fagos dirigidos a E. coli O157:H7 en pieles de ganado) y en alimentos (por ejemplo, fagos dirigidos a Salmonella en aves o carne). Estas directrices se desarrollaron utilizando preparados de fagos específicos. Sin embargo, en general, cualquier producto de fagos que se ajuste a la descripción de la directriz puede considerarse conforme. Siguiendo el ejemplo de las autoridades reguladoras de Estados Unidos, varias autoridades sanitarias de países de todo el mundo han otorgado autorizaciones para productos de fagos para su uso en alimentos. Algunos ejemplos son Israel, Canadá, Suiza, Australia, Nueva Zelanda y la Unión Europea (Tabla 2).
3.2. Desafíos para el biocontrol con bacteriófagos
Como se describe en las secciones anteriores, el biocontrol con bacteriófagos se utiliza cada vez más para combatir bacterias patógenas específicas en diversos alimentos, con un número creciente de publicaciones científicas que demuestran la utilidad de los bacteriófagos para reducir o erradicar sus bacterias patógenas objetivo en alimentos. Sin embargo, aún quedan algunos desafíos pendientes antes de que el biocontrol con bacteriófagos sea aceptado de forma generalizada, incluidas limitaciones técnicas y la aceptación general por parte de los consumidores de la aplicación de fagos en alimentos. Algunos de estos desafíos se discuten brevemente a continuación.
3.2.1. Desafíos técnicos
Posiblemente el mayor desafío técnico en el biocontrol con fagos es su eficacia. Una observación frecuente en estudios con bacteriófagos en alimentos es que el nivel de bacterias contaminantes disminuye inicialmente y, posteriormente, hay poca o ninguna reducción adicional de las bacterias [54, 56]. En otras palabras, los fagos pueden reducir eficazmente el nivel de sus bacterias objetivo en alimentos, pero no siempre las eliminan por completo. Los bacteriófagos deben entrar en contacto con células bacterianas susceptibles para lisarlas. Considerando la naturaleza del ciclo de replicación de los fagos (que comienza con un fago infectando una célula bacteriana y, al final de cada ciclo de replicación, 100-200 fagos descendientes salen de esa célula, es decir, un efecto exponencial), se podría esperar que esta reducción en las células bacterianas aumente exponencialmente con más ciclos de replicación, ya que se generan más fagos descendientes como resultado de la lisis bacteriana mediada por fagos en curso. Sin embargo, varios informes han señalado que la concentración de fagos no aumenta sustancialmente después de su aplicación en alimentos [43, 44, 45], lo que sugiere fuertemente que la «autodosificación» (aumento exponencial de la población de fagos debido a ciclos de replicación lítica repetidos) no está ocurriendo, al menos bajo las condiciones probadas hasta ahora. Es probable que los fagos descendientes no puedan alcanzar y penetrar bacterias adicionales en los alimentos, especialmente en matrices alimentarias más secas, donde el movimiento pasivo de los fagos sobre las superficies de los alimentos está limitado debido a la falta de humedad. En este contexto, se ha sugerido que podrían requerirse menos partículas de fagos para reducir significativamente la contaminación bacteriana en superficies de alimentos húmedas y en líquidos en comparación con matrices alimentarias más secas, presumiblemente debido a la mayor «movilidad» de los fagos en presencia de humedad (por ejemplo, jugos naturales de algunos alimentos) [84]. Una posible respuesta a este desafío es el uso de una solución de fagos con concentraciones más altas de partículas de fagos para aumentar la probabilidad de que los fagos entren en contacto con sus bacterias objetivo al aplicarse [17, 21, 36, 66]; sin embargo, una solución más concentrada es más costosa, por lo que su implementación puede resultar prohibitiva para los procesadores de alimentos. Otra opción es el uso de volúmenes de pulverización mayores, aplicados mediante nebulizaciones finas, para distribuir las partículas de fagos de manera más eficiente sobre la superficie del alimento y aumentar la probabilidad de que encuentren una bacteria objetivo, lo que podría ser especialmente importante en circunstancias en las que los patógenos están presentes en alimentos en concentraciones muy bajas o cuando la dosis infecciosa del patógeno es extremadamente baja. La aplicación adecuada de bacteriófagos en alimentos para garantizar una cobertura superficial completa y una eficacia óptima es uno de los desafíos técnicos más importantes para el biocontrol con fagos e incluye una serie de aspectos que dependen de la dosificación de los fagos (es decir, la concentración eficaz de fagos administrados en un volumen óptimo y cómo se puede verificar esto en las instalaciones de procesamiento de alimentos), hasta obtener el equipo adecuado (tanto para garantizar una dosificación precisa, como se acaba de mencionar, como para asegurar una mezcla o agitación adecuada durante la aplicación de fagos, de modo que toda la superficie del alimento se trate completamente con la solución de fagos).
Otro problema relacionado con la eficacia es que el biocontrol con fagos suele reducir la concentración de bacterias objetivo en 1-3 log (con raras excepciones: en un estudio se informó de una reducción de hasta 5 log de Listeria como resultado del tratamiento con fagos [36]), y esto es considerablemente inferior a la reducción de hasta 5 log informada para algunas otras intervenciones más duras, como la irradiación. Aunque esto es más un problema de percepción que un problema técnico real (ya que muy pocos alimentos, si es que hay alguno, están contaminados con 5 log de patógenos transmitidos por alimentos por gramo), la menor reducción es considerada inferior por la industria alimentaria. Incluso si la bacteria objetivo no se elimina completamente de los alimentos y solo se reduce en 1 o 2 logaritmos, puede hacer que el alimento sea más seguro para el consumo. Por ejemplo, en 2003, la FDA y el FSIS del USDA elaboraron conjuntamente un estudio de evaluación de riesgos en el que modelaron una serie de escenarios hipotéticos, incluido un escenario en el que se evaluaría cómo afectaría una reducción de la contaminación en embutidos a la tasa de mortalidad en personas mayores. Según este análisis, una reducción de 10 veces (1 log) y una reducción de 100 veces (2 log) de la contaminación antes de la venta con L. monocytogenes reduciría la tasa de mortalidad en aproximadamente un 50% y 74%, respectivamente, en este segmento de población [85]. Por lo tanto, la implementación de protocolos de biocontrol con fagos, incluso si no erradican (es decir, no eliminan completamente) los patógenos contenidos en los alimentos, sino que los reducen en 1-3 log, puede conducir a mejoras significativas en la seguridad alimentaria y la salud pública.
Otro desafío técnico se refiere a la implementación del biocontrol con fagos. El biocontrol con fagos es una herramienta eficaz para mejorar la seguridad alimentaria, pero no elimina la necesidad de una manipulación segura de los alimentos. Por ejemplo, se ha observado un nuevo crecimiento de bacterias después de un tratamiento con fagos cuando los alimentos se almacenaron a temperaturas de abuso [33, 48, 54]. Además, se requiere cierta planificación para mantener la eficacia óptima del biocontrol con fagos cuando los bacteriófagos se combinan con algunas otras medidas de seguridad alimentaria, como el uso de fagos junto con desinfectantes químicos [59]. Por ejemplo, varios desinfectantes químicos son capaces de inactivar fagos y, por lo tanto, deben aplicarse por separado para garantizar que los fagos conserven su viabilidad y logren las mayores reducciones bacterianas [59]. En este contexto, algunos investigadores han informado de que las combinaciones de bacteriófagos y conservantes son menos eficaces que cada tratamiento por separado [86]. Sin embargo, si se identifican combinaciones sinérgicas adecuadas de preparados de fagos con otros desinfectantes, podría mejorarse la eficacia de cada uno. Por ejemplo, en presencia de altas cargas orgánicas, se aumentó la eficacia de un lavado con productos de ácido levulínico (hasta 2 log) cuando las frutas y verduras se pretrataron con un preparado de bacteriófagos [34].
Otro desafío técnico relacionado con la aplicación (y que afecta a la eficacia) es la posible aparición de aislados bacterianos resistentes a los fagos. Los investigadores recuperan bacterias que son resistentes a los tratamientos con fagos [62], y existe la preocupación de que la aplicación generalizada de este tratamiento pueda conducir finalmente a una selección de bacterias resistentes a los fagos.Los fagos utilizan una variedad de estructuras bacterianas para iniciar la invasión de células bacterianas, incluidos polisacáridos y proteínas de superficie, así como los flagelos [87, 88, 89]. El uso de cócteles de fagos que contengan múltiples fagos diferentes (por ejemplo, fagos que utilicen diferentes receptores en la superficie de las bacterias) frente a un único monofago puede proporcionar un mecanismo para reducir el riesgo/probabilidad de resistencia bacteriana. La propia estrategia de intervención también puede desempeñar un papel clave en la aparición de mutantes resistentes a los fagos. Por ejemplo, aplicar fagos al final del ciclo de procesamiento de alimentos (por ejemplo, cuando los fagos se pulverizan sobre los alimentos inmediatamente antes del envasado) reduce la «presión selectiva total» en el entorno, ya que la exposición bacteriana a los fagos es limitada. Como resultado, existe un menor riesgo de que surjan mutantes resistentes a los fagos que si, por ejemplo, se pulverizaran gallineros u otros entornos complejos similares con fagos para reducir la contaminación del ganado. Finalmente, si surge resistencia, los cócteles de fagos podrían modificarse para incluir fagos que se dirijan a bacterias previamente resistentes. Ya se ha publicado un ejemplo de tal enfoque y se discute en otra parte de este artículo [16].
3.2.2. Aceptación del consumidor
En los últimos años, los consumidores han mostrado cada vez más una aversión a comprar alimentos tratados con desinfectantes químicos y antibióticos o alimentos «modificados genéticamente», mientras que al mismo tiempo ha aumentado la demanda de alimentos y productos orgánicos de producción local, como en los mercados agrícolas locales y en la agricultura apoyada por la comunidad (CSA) [90, 91]. Esta tendencia es una buena señal para el biocontrol con fagos, que ofrece un enfoque antimicrobiano no químico, respetuoso con el medio ambiente y dirigido para mejorar la seguridad alimentaria. Sin embargo, es posible que el público no esté dispuesto a comprar alimentos procesados con técnicas desconocidas, y la idea de «pulverizar virus sobre sus alimentos» podría generar incomodidad. Además, los fabricantes de alimentos en general son reacios a cambiar sus prácticas, especialmente cuando existe la posibilidad de que el público reaccione negativamente. Para que el biocontrol con fagos se implemente a mayor escala, es fundamental educar al público y a los procesadores de alimentos sobre la seguridad, eficacia y ubicuidad de los bacteriófagos.
Los fagos son los organismos más abundantes del planeta, con aproximadamente 1031 partículas (diez veces más que toda la población bacteriana global) [92] y aproximadamente 1015 partículas de fagos que pueblan el intestino humano [93]. Los fagos forman parte de la microflora normal de todos los alimentos frescos [94] y se han aislado de una variedad de alimentos, desde frutas y verduras hasta carne y productos lácteos, a menudo en cantidades muy elevadas, por ejemplo, hasta 1 × 109 UFP/ml en yogur [95, 96]. El biocontrol con fagos es probablemente también una de las intervenciones más respetuosas con el medio ambiente que existen. En una revisión anterior [18] estimamos que, si los fagos se aplicaran en la cantidad máxima permitida (109 UFP/g para un producto de fagos; todas las demás autorizaciones actuales son de hasta 107-108 UFP/g) a todos los alimentos autorizados que consume un estadounidense promedio en un día, los fagos ingeridos representarían menos del 0,2% del número de fagos ya presentes en el intestino humano. Este cálculo es una sobreestimación aproximada, especialmente teniendo en cuenta varias autorizaciones GRAS que permiten una aplicación de hasta 108 UFP/g (reduciendo la ingesta diaria de fagos a aproximadamente el 0,02% de los fagos en el tracto intestinal humano). Esta estimación también asume que (1) se tratan todos los alimentos posibles, (2) todos los fagos aplicados sobreviven al ácido gástrico y llegan al intestino delgado (sin embargo, la mayoría de los fagos normalmente se destruyen cuando se exponen al pH ácido del estómago), (3) se aplica la cantidad máxima permitida de fagos y (4) el biocontrol con bacteriófagos es utilizado universalmente por todas las industrias alimentarias relevantes en Estados Unidos. En resumen, el número de fagos que se añaden al medio ambiente y se introducen en el intestino humano como resultado del biocontrol con fagos es insignificante, especialmente en comparación con las poblaciones de fagos que ocurren naturalmente. Además, los fagos en todos los productos comerciales actualmente disponibles (Tabla 2) no están modificados genéticamente y se originan en el medio ambiente, posiblemente incluso en alimentos. Sin embargo, el público a menudo desconoce estos hechos. Por lo tanto, la comprensión adecuada de la seguridad y ubicuidad de los fagos líticos, así como de las ventajas y desventajas del biocontrol con fagos entre consumidores y procesadores de alimentos es fundamental para la implementación exitosa continua de este enfoque prometedor. En al menos un estudio reciente, los consumidores parecían estar dispuestos a pagar más por productos frescos tratados con bacteriófagos después de que se les explicara la ciencia detrás del biocontrol con fagos y los beneficios de esta técnica [97].
4. Observaciones finales
Aunque aún persisten algunos desafíos, el biocontrol con bacteriófagos se acepta cada vez más como un método seguro y eficaz para eliminar o reducir significativamente los niveles de patógenos bacterianos específicos en alimentos. Los productos comerciales de bacteriófagos están actualmente disponibles y autorizados para su uso en un número creciente de países. Estos productos pueden utilizarse para combatir la contaminación por patógenos bacterianos específicos en diferentes momentos durante la producción de alimentos, incluida la pulverización sobre productos agrícolas, la aplicación en animales de granja antes del procesamiento, el enjuague de superficies de contacto con alimentos en instalaciones de procesamiento y el tratamiento de alimentos poscosecha, incluidos alimentos listos para consumir.A pesar de los avances en la mejora de la seguridad alimentaria, las enfermedades transmitidas por alimentos siguen siendo una amenaza constante, especialmente para personas con sistemas inmunitarios más débiles, como niños, personas mayores y mujeres embarazadas. El biocontrol con bacteriófagos puede servir como herramienta adicional en un enfoque de múltiples barreras para evitar que los patógenos transmitidos por alimentos lleguen a los consumidores. Este método es especialmente prometedor cuando los procesadores de alimentos desean preservar la población microbiana natural y a menudo beneficiosa de los alimentos mientras eliminan las bacterias que pueden causar enfermedades en humanos.
Agradecimientos
Este material se basa en trabajos respaldados en parte por el US Army Contracting Command (APG), Natick Contracting Division, Natick, MA, EE. UU., bajo el contrato número #W911QY-18-C-0010 (a Alexander Sulakvelidze). Los financiadores no participaron en la concepción de esta revisión bibliográfica, la decisión de publicar o la elaboración del manuscrito.
Fuente: Zachary D. Moye, Joelle Woolston y Alexander Sulakvelidze
https://www.mdpi.com/1999-4915/10/4/205/htm
https://www.mdpi.com/1999-4915/10/4/205/htm
