Met fagen tegen alcoholgerelateerde leverschade?

De behandelingsmogelijkheden voor alcoholische hepatitis, een leveraandoening die verband houdt met hoog alcoholgebruik, zijn beperkt. Studies bij muizen tonen aan dat de micro-organismen die verantwoordelijk zijn voor deze aandoening kunnen worden bestreden door middel van een virale behandeling.

In 1984 gebruikte microbioloog Barry Marshall zichzelf notoir als proefpersoon voor zijn onderzoek en dronk de inhoud van een fles met het bacterium Helicobacter pylori om aan te tonen dat bacteriën maagzweren veroorzaken1. Duan et al.2, die in Nature schrijven, melden niet dat zij dergelijke drastische maatregelen nemen om een bacterieel verband met een ziekte te onderzoeken. Desondanks levert hun zorgvuldige analyse van een leveraandoening genaamd alcoholische hepatitis in studies bij muizen en de analyse van monsters van mensen die aan de ziekte lijden, ook opvallend bewijs voor de betrokkenheid van een vermoedelijke bacteriële dader.
Alcoholische hepatitis is een slecht begrepen aandoening die verband houdt met hoog alcoholgebruik en moeilijk te behandelen is. Eerdere experimenten bij muizen hebben aangetoond dat de darmbacterie Enterococcus faecalis betrokken zou kunnen zijn3. E. faecalis wordt echter meestal beschouwd als een oude vriend die de darmen van veel dieren in de gehele evolutionaire boom bewoont, van mensen tot nematoden4, en doorgaans minder dan 0,1% van alle bacteriën in ontlastingsmonsters van gezonde mensen vertegenwoordigt5. Na antibiotische behandeling nemen de bacteriën van het geslacht Enterococcus echter toe in prevalentie en worden zij een van de meest voorkomende soorten microben in de darm6. E. faecalis kan bloed, hart, blaas en hersenen infecteren, evenals tanden die een wortelkanaalbehandeling hebben ondergaan7,8.

Duan en collega’s analyseerden menselijke ontlastingsmonsters. Zij identificeerden E. faecalis in de ontlasting van ongeveer 80% van de mensen met alcoholische hepatitis die zij testten, en ongeveer 30% van de stammen van E. faecalis had genen die coderen voor een toxine genaamd cytolysin. Bovendien hadden mensen met de ziekte bijna 3.000 keer meer E. faecalis in hun ontlastingsmonsters dan mensen die geen alcoholische hepatitis hadden. Dat is geen concreet bewijs dat de ziekte door deze bacterie wordt veroorzaakt. De gegevens van de auteurs tonen echter ook aan dat de aanwezigheid van cytolysin in de ontlasting correleert met de mortaliteit – 89% van de mensen van wie de ontlastingsmonsters cytolysin bevatten, stierf binnen 180 dagen na ziekenhuisopname, vergeleken met slechts 3,8% van de mensen die aan alcoholische hepatitis leden, maar van wie de ontlastingsmonsters het gif misten.
De auteurs onderzochten vervolgens het verband tussen E. faecalis en leveraandoeningen bij muizen. De dieren werden gekoloniseerd met stammen van E. faecalis die ofwel cytolysin produceerden of niet, en sommigen kregen vervolgens een alcoholrijk dieet, terwijl anderen een alcoholvrij dieet kregen. Alleen de muizen die gekoloniseerd waren met cytolysin-producerende E. faecalis ontwikkelden leverschade (Fig. 1a).

Vervolgens transplanteerden de auteurs met kiemvrije muizen (die geen natuurlijke micro-organismen hadden) ontlastingsmonsters van mensen met alcoholische hepatitis die E. faecalis-stammen bevatten waarin cytolysin ofwel aanwezig of afwezig was. Muizen op een dieet met hoog alcoholgehalte die gekoloniseerd waren met cytolysinbevattende ontlasting, vertoonden een reeks tekenen van leverschade en het afsterven van levercellen, terwijl dieren op een dergelijk dieet die gekoloniseerd waren met ontlasting zonder cytolysin geen grote tekenen van leverschade vertoonden.

Om de ziekteverwekkende mechanismen te begrijpen, isoleerden de auteurs levercellen uit de dieren en ontdekten dat de celdood als reactie op de cytolysin-blootstelling dosisafhankelijk was. De reactie op cytolysin was hetzelfde, ongeacht of de muizen een alcoholrijk dieet hadden gekregen of niet. Dit suggereert dat in plaats van dat alcohol alcoholische hepatitis veroorzaakt door levercellen te beschadigen, schade ontstaat doordat alcohol de doorlaatbaarheid van het darmslijmvlies verhoogt, waardoor cytolysin-producerende E. faecalis de lever kan bereiken en ziektesymptomen kan veroorzaken (Fig. 1a).
Gezien de beperkte behandelingsmogelijkheden van alcoholische hepatitis onderzochten de auteurs of er stappen konden worden ondernomen om een therapie te ontwikkelen die gebruikmaakt van bacteriespecifieke virussen, zogenaamde bacteriofagen, kortweg fagen. Fagen hebben ten opzichte van antibiotica het voordeel dat zij zeer specifiek zijn, en zo wordt vermeden dat ook nuttige bacteriën worden gedood. Omdat het oppervlak van een menselijke cel wezenlijk verschilt van dat van een bacteriecel, wordt niet aangenomen dat fagen dierlijke of menselijke cellen infecteren9.

Fagen worden al bijna 100 jaar gebruikt om Salmonella- en Shigella-bacteriën uit geïnfecteerde menselijke darmen te verwijderen10. Zij zijn ook gebruikt om de ziekteverwekkende bacterie Clostridium difficile uit kunstmatige darmen en van hamsters die met deze bacterie geïnfecteerd zijn, te verwijderen11,12. Er is gesuggereerd dat zij op een dag bij mensen of dieren zouden kunnen worden gebruikt om de samenstelling van de gemeenschap van darmmicro-organismen (de microbiota) te hervormen, om een gezondere microbiota te produceren die bestaat uit meer bacteriën die met een goede gezondheid worden geassocieerd, en minder die met ziekten worden geassocieerd13. Het potentieel van op E. faecalis gerichte fagen om menselijke ziekten te bestrijden wordt al besproken7, en fagen kunnen antibioticaresistente stammen van E. faecalis in verband met menselijke bot- en wondinfecties14,15 en tandcariës16 doden. Bovendien worden fagen ontwikkeld voor gebruik in de voedingsindustrie om E. faecalis uit kaasculturen te verwijderen en de productie van toxische afvalproducten te voorkomen17.

Om te testen of een methode kan worden ontwikkeld om cytolysin-producerende E. faecalis specifiek uit muizen te verwijderen, identificeerden de auteurs enkele fagen die zich op deze bacteriën richten (Fig. 1b), maar andere darmbacteriën ongemoeid laten. Muizen die menselijke ontlastingsmonsters en een alcoholrijk dieet kregen en aan wie op E. faecalis gerichte fagen werden toegediend, hadden minder leverschade dan muizen die fagen kregen die een andere bacterie doodden die normaal gesproken niet bij dieren voorkomt.
Deze studie toont de voordelen aan van het gebruik van fagen in het detectivewerk om de bijdragen van microben aan ziekte te onderzoeken. De auteurs tonen aan dat fagen kunnen worden gebruikt om ziekteverwekkende bacteriële componenten te identificeren, en benadrukken ook de mogelijkheid dat fagen potentiële behandelingsmogelijkheden zouden kunnen bieden. Verdere tests, inclusief klinische studies, zouden nodig zijn om te beoordelen of een fagenbenadering in een menselijke context zinvol zou zijn. Bijvoorbeeld, de fagenbehandeling kan helpen om E. faecalis in de darm te bestrijden voordat een persoon een levertransplantatie krijgt.

In de studie van Duan en collega’s zouden de fagen een ziekte kunnen behandelen waarbij een oorzakelijke component een bacterie is die zich normaal gesproken in de darm bevindt, hoewel de ziekteplaats zich elders in het lichaam bevindt. Hoewel veel fagenonderzoekers zich richten op het gebruik van deze virussen voor de behandeling van ziekten die verband houden met antibioticaresistente bacteriën, vergroot het werk van Duan et al. de mogelijkheid van een veel bredere klinische rol voor hen. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat darmmicroben de functie van bepaalde cellen in de hersenen kunnen beïnvloeden, en er lopen studies om vast te stellen of dergelijke microben een rol spelen bij menselijke hersenaandoeningen (zie go.nature.com/2cp1kfk). Misschien zouden fagen deel kunnen uitmaken van de volgende generatie gerichte antimicrobiële therapieën voor ziekten die momenteel moeilijk te behandelen zijn. In feite zouden er veel ziekten kunnen zijn waarvan wij momenteel niet weten dat zij een microbiële component hebben en die door fagen zouden kunnen worden bestreden.

Vertaling van de bron: https://www.nature.com/articles/d41586-019-03417-3?WT.ec_id=NATURE-201911&sap-outbound-id=B1DB46EE2E53C2F97DD8759AF0246E5D0F9AD1F4&mkt-key=005056A5C6311ED8AAB34565834CF148
Martha R. J. Clokie is verbonden aan het Department of Genetics and Genome Biology, University of Leicester, Leicester LE1 7RH, UK.
Nature 575, 451-453 (2019)
doi: 10.1038/d41586-019-03417-3

Faagspecifieke diverse effecten van bacteriële virussen op het immuunsysteem

“Met de toenemende dreiging van antibioticaresistentie is de belangstelling voor faagtherapie (PT) als mogelijke oplossing voor deze crisis snel toegenomen. Recentelijk zijn er verschillende rapporten gepubliceerd die een succesvolle behandeling beschrijven van patiënten met levensbedreigende antibioticaresistente bacteriële infecties, waaronder ontvangers van longtransplantaties en behandeling met genetisch gemodificeerde fagen. Bovendien werd in de VS het eerste PT-centrum geopend, nadat in België een vergelijkbare eenheid was opgericht. Deze ontwikkelingen bevestigen onze beslissing om in 2005 de eerste dergelijke eenheid op te richten, die in overeenstemming met de UKORE en de nationale voorschriften werkt, wat heeft bijgedragen aan het effenen van de weg voor toekomstige vooruitgang in PT als optie om de crisis van antibioticaresistentie te bestrijden. Uitgebreid bewijs uit observationele studies wijst op de veiligheid van PT. Bovendien zijn er verschillende klinische studies voltooid (waaronder één volgens alle vereiste normen van goede medische praktijk en evidence-based medicine) en lopen er nog. Deze studies moeten echter nog het definitieve bewijs leveren van de werkzaamheid van PT[1-4]. Terwijl de strijd om de registratie en marktintroductie van fagen als geneesmiddel voortduurt, hebben zich parallelle gegevens opgehoopt die erop wijzen dat fagen niet alleen met bacteriën kunnen interageren, maar ook met eukaryotische cellen (inclusief cellen van het immuunsysteem). Daarom kan niet worden uitgesloten dat het onderzoek zich in de toekomst, na de ontdekking van fagen, zal verleggen in de richting van faag-immuunsysteem-interacties, terwijl tot nu toe het werk aan faag-interacties met hun natuurlijke doelwit (bacteriën) heeft gedomineerd. Er blijft te hopen dat gelijktijdige vooruitgang in beide onderzoeksgebieden positieve resultaten kan opleveren voor de menselijke gezondheid, zowel bij de bestrijding van antibioticaresistente bacteriële infecties als bij de ontwikkeling van nieuwe ontstekingsremmende en immunomodulerende stoffen met minimale toxiciteit en bevredigende werkzaamheid[4,5].

Wij hebben een hypothese geformuleerd die stelt dat fagen die in de darm aanwezig zijn, kunnen migreren naar bloed, lymfe en organen, ontstekingsremmende effecten kunnen bemiddelen en kunnen bijdragen aan immunologische tolerantie en immuunhomeostase – zowel in situ als op andere plaatsen in het lichaam[6]. De studieresultaten bevestigen dit en bovendien ondergaan dagelijks meer dan 30 miljard fagen een transcytose van het darmepitheel en verspreiden zich naar bloed, lymfe en organen[7]. Bovendien kunnen ook andere celtypen, inclusief immuuncellen, via de endocytische weg fagen opnemen[8].

Het nieuw opkomende concept van de faag, dat niet alleen bacteriële roofdieren omvat, maar ook potentiële ontstekingsremmende en immunomodulerende stoffen, vereist een gedetailleerd verder onderzoek. Een kritiek punt dat moet worden opgehelderd, is de faagspecificiteit bij het bemiddelen van bepaalde immuunreacties. Fagen staan bekend om hun hoge specificiteit ten opzichte van bacteriën, die al tientallen jaren is vastgesteld en wordt gebruikt in faagtypering voor de classificatie van verschillende bacteriestammen. Zijn immunotrope activiteiten ook faagspecifiek of induceren fagen vergelijkbare reacties, onafhankelijk van het faagtype?

Er wordt aangenomen dat faagkapsideproteïnen in de eerste plaats verantwoordelijk kunnen zijn voor de biologische eigenschappen van de faag die niet samenhangen met interacties met bacteriën. Deze proteïnen verschillen in hun immunogeniciteit en kunnen verschillende antilichaamreacties op fagen oproepen, wat ook afhangt van de toedieningsweg. Bovendien kunnen verschillende stammen van een homologe faag, die een bepaalde bacterie herkennen, verschillende proteïnen tot expressie brengen[9,10] en de faag verschillende functies verlenen (bijv. persistentie in de circulatie en antimetastatische effecten). Zo is bijvoorbeeld een T4-faagmutant, HAP1, met een niet-functioneel Hoc-proteïne gevoeliger voor de Kupffer-cellen van de lever en wordt sneller geklaard dan zijn ouderstam. Ook zijn er verschillen tussen HAP1 en T4-fagen in hun interacties met T-cellen en fibrinogeen[11,12].
Eerste studies over de effecten van fagen op andere immuunfuncties suggereren dat de effecten ook kunnen verschillen afhankelijk van het faagtype. Zo remt bijvoorbeeld de gezuiverde T4-colifaag de via het CD3-TCR-complex geïnduceerde menselijke T-celproliferatie, terwijl de gezuiverde stafylokokkenfaag een co-stimulerend effect uitoefent[12]. Een gedetailleerde studie over stafylokokken- en Pseudomonas-fagen toonde aan dat, hoewel deze fagen vergelijkbare reacties induceerden in mononucleaire cellen van menselijk perifeer bloed, door opregulatie van de genexpressie van ontstekingsremmende cytokines IL-1-receptorantagonisten en van suppressors van het cytokinesignaal 3, hun invloed op andere immuunfuncties beperkt was tot de specifieke faag. Een protolerogeen en ontstekingsremmend cytokine IL-10 werd geïnduceerd door alle geteste Pseudomonas-fagen, maar niet door een stafylokokkenfaag. Anderzijds veroorzaakte laatstgenoemde faag TNFα, terwijl slechts twee van de vier onderzochte Pseudomonas-fagen vergelijkbare effecten hadden. Bovendien werd het TLR4-gen uitsluitend door een Pseudomonas PMN-faag neergereguleerd, wat wijst op zijn ontstekingsremmende werking (de TLR4-activering bewerkstelligt de secretie van pro-inflammatoire cytokines)[13]. De diversiteit van de faagwerking op het immuunsysteem werd ook bevestigd door recentere gegevens die aantonen dat een filamenteuze Pseudomonas Pf-faag de TNF-productie en fagocytose remt, terwijl Escherichia coli filamenteuze Fd-faag geen dergelijke effecten heeft[8]. Bovendien suggereren onze gegevens dat zowel T4-colifaag als A5/80 Staphylococcus aureus-faag de expressie van menselijke adenovirusgenen significant verminderen, maar de synthese van viraal DNA wordt alleen door T4-colifaag geremd[14]. Bovendien zijn er aanwijzingen dat gematigde en lytische fagen kunnen verschillen in hun effect op het immuunsysteem[8]. Profagen zijn inderdaad de belangrijkste factor voor de bacteriële heterogeniteit van het immuunsysteem tussen de stammen, die zich manifesteert als variatie van de adaptieve T- en B-celimmuunreacties van menselijke lymfocyten in vitro op S. aureus en Streptococcus pyogenes[15].

Immunomodulerende en ontstekingsremmende effecten van fagen kunnen ook cel- en weefselspecifiek zijn. De intranasale toediening van 536_P1 (maar niet LM33-P1) colifaag bij muizen met experimentele longontsteking leidde tot een toename van de antivirale longcytokines en chemokines. Geen van beide fagen veroorzaakte veranderingen in het bloedcytokine-/chemokinegehalte, wat ook suggereert dat faageffecten op het immuunsysteem verschillende manifestaties kunnen hebben in verschillende compartimenten van het lichaam[16]. Het vermogen van de faag om weefselspecifieke activiteit te bemiddelen, wordt bevestigd door Pincus et al.[17], waar de stafylokokkenfaag geen pro-inflammatoire cytokines heeft geïnduceerd in mononucleaire cellen van menselijk perifeer bloed, maar IFN-γ heeft kunnen induceren in menselijke keratinocyten. Bovendien hebben wij aangetoond dat A5/80 stafylokokkenfaag de expressie van IL-2 verhoogt in de A549-cellijn[18]; een activiteit die voor de faagwerking op andere celtypen in in-vitrostudies nog niet is gerapporteerd. Een toename van de serum-IL-2-spiegels als reactie op de toediening van fagen werd recentelijk ook gerapporteerd bij muizen die werden behandeld met Acinetobacter baumannii-fagen, maar hun cellulaire bron is onbekend[19].

Zoals reeds vermeld, suggereren recente gegevens dat fagen door zoogdiercellen kunnen worden geïnternaliseerd en een groot aantal transcytoses via darmepitheel cellen kunnen ondergaan, terwijl immuuncellen ook fagen internaliseren, met name dendritische cellen (DC’s), monocyten en B-cellen[7,8]. Onlangs hebben wij een duidelijke faagafhankelijke stimulatie van het Hsp72-gen beschreven[18]. Deze inductie van een bekend cellulair chaperon kan een mechanisme zijn om cellen die transcytose ondergaan te beschermen tegen mogelijke schade door intracellulaire fagen. Bovendien is bekend dat Hsp72 de T-celproliferatie en de cytokinesecretie vermindert, onafhankelijk van de gebruikte stimuli, en het DC-vermogen om allogene T-cellen te stimuleren remt. Dit kan erop wijzen dat Hsp72 als immunomodulator zou kunnen worden gebruikt[20]. Er is ook aangetoond dat het experimentele artritis bij ratten onderdrukt[21]. Wij hebben gerapporteerd dat fagen de ontwikkeling van collageengeïnduceerde artritis bij muizen kunnen remmen, een experimenteel model van reumatoïde artritis[22]. Interessant genoeg is in dit model ook aangetoond dat Hsp72 artritis onderdrukt[23]. Het kan zeer wel zijn dat de faagafhankelijke inductie van Hsp72 ten minste gedeeltelijk verantwoordelijk is voor de remming van de door de faag veroorzaakte abnormale immuunreacties (inclusief auto-immuniteit en hyperinflammatie)[24].
Faaginteracties met immuuncellen kunnen afhankelijk zijn van specifieke faagreceptoren die deze interacties mogelijk maken. Over de aard van dergelijke receptoren zijn momenteel slechts weinig gegevens beschikbaar. Pruzzo et al.[25] stelden voor dat de colifagen T3 en T7 met hun receptoren voor Klebsiella pneumoniae aan epitheelcellen zouden kunnen hechten. Onze hypothese wees op een Lys-Gly-Asp (KGD)-sequentie die aanwezig is in een van de kapsideproteïnen van de T4-faag als potentiële ligand voor cellulaire integrinereceptoren[24]. Lehti et al. toonden aan dat E. coli-faag neuroblastoomcellen kan herkennen en binden die polysialinezuur op hun oppervlak hebben[26]. Als polysialinezuur inderdaad een ligand is voor receptoren van sommige fagen, zou het deze fagen in staat kunnen stellen om aan immuuncellen te binden, aangezien de aanwezigheid van polysialinezuur ook is aangetoond op menselijke DC’s, NK-cellen en een subpopulatie van T-cellen[27,28]. Het is dus waarschijnlijk dat verschillende fagen verschillende cellulaire liganden kunnen gebruiken om zich te binden aan en te transcytoseren naar doelcellen, inclusief die van het immuunsysteem. Met name kan reeds een enkele aminozuursubstitutie in een faagkapsideproteïne een >1000-voudige verbetering van de faagoverleving in de muizencirculatie bewerkstelligen, wat waarschijnlijk gewijzigde interacties tussen fagen en fagocyten (en misschien andere cellen die fagen endocyteren) weerspiegelt[29].

Fagen richten zich niet alleen op bepaalde bacteriën, maar kunnen – althans gedeeltelijk – ook faagspecifieke immuunreacties veroorzaken. Deze resultaten openen een nieuw spannend veld voor verder onderzoek naar de betekenis van dergelijke reacties voor gezondheid en ziekte. Bovendien suggereren deze gegevens dat een bepaalde faag optimaal zou kunnen worden geselecteerd voor gebruik in PT uit verschillende faagstammen die een bepaalde bacterie herkennen, waarbij zowel zijn antibacteriële activiteit als de aard van de immuunreactie die hij kan oproepen in aanmerking worden genomen. Dit is belangrijk bij patiënten met immuundeficiënties, auto-immuniteit, ontvangers van allotransplantaten enz., die – afhankelijk van de aard van hun aandoening – immuunstimulatie of immunosuppressie nodig hebben. Uiteraard kan verder onderzoek op dit gebied de weg effenen voor het gebruik van specifieke fagen in immunomodulatie.”

Vertaling van de bron: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6802706/

Phage-specific diverse effects of bacterial viruses on the immune system
Andrzej Górski, Ryszard Międzybrodzki, Ewa Jończyk-Matysiak, Maciej Żaczek, and Jan Borysowski

Een historisch overzicht van fagetherapie als alternatief voor antibiotica voor de behandeling van bacteriële ziekteverwekkers

Met de introductie van het nieuwe Bacteriophage-Journal begin 2011 definieerde Alexander Sulakvelidze bacteriofagen als “de meest ubiquitaire organismen op aarde, die een belangrijke rol spelen bij het handhaven van het microbiële evenwicht op deze planeet.” Er werd vastgesteld dat bacteriofagen, of fagen, overal aanwezig zijn waar hun bacteriële gastheer voorkomt, en dat de populatie fagen in watersystemen varieert van 10^4 tot 10^8 virionen per ml en ongeveer 10^9 virionen per g in de bodem. . FEMS Microbiol met een geschat totaal van 10^32 bacteriofagen op de planeet.

Bacteriofagen: een beoordeling van hun rol bij de behandeling van bacteriële infecties. Fagen, bijna een eeuw geleden beschreven door William Twort en kort daarna onafhankelijk ontdekt door Félix d’Herelle (door velen beschouwd als de grondlegger van bacteriofagen en hun therapeutische betekenis: fagetherapie), zijn kleine virussen die de capaciteit hebben om bacteriën te doden zonder de cellijnen van andere organismen te beïnvloeden. Vanwege de specificiteit van de cellulaire doelgastheren is de toepassing van fagen sinds hun introductie voorgesteld als therapie voor de behandeling van acute en chronische infecties, met aanvankelijke successen die voor het eerst werden beschreven in de disciplines dermatologie, oogheelkunde, urologie, stomatologie, kindergeneeskunde, KNO en chirurgie.

De aanvankelijke passie voor fagetherapie ter behandeling van bacteriële ziekten in het pre-antibiotica-tijdperk was begrijpelijkerwijs enorm. De enige beschikbare therapie in de jaren 1920 en 1930 was inderdaad serumtherapie voor geselecteerde pathogenen zoals pneumokokken en difterie. Het gebruik van bacteriofagen werd zelfs met grote belangstelling beschreven toen de hoofdpersoon van Sinclair Lewis’ met een Pulitzerprijs bekroonde roman, Arrowsmith, deze behandeling gebruikte om de uitbraak van de builenpest op een Caribisch eiland te bestrijden.

Dit concept van therapeutisch gebruik van fagen voor de behandeling van bacteriële infecties was echter vanaf het begin zeer controversieel en werd niet algemeen aanvaard door het publiek en de medische gemeenschap. Vroege studies werden vaak bekritiseerd vanwege het ontbreken van geschikte controles en inconsistente resultaten. Het gebrek aan reproduceerbaarheid en de vele tegenstrijdige resultaten die in de verschillende gepubliceerde studies werden verkregen, leidden tot de conclusie dat het bewijs voor de therapeutische waarde van lytische filtraten grotendeels tegenstrijdig en niet overtuigend was, en er werd aanvullend onderzoek aanbevolen om de vermeende voordelen ervan te bevestigen. De opkomst van het antibiotica-chemotherapie-tijdperk met de introductie van sulfapreparaten in de jaren 1930 en later penicilline in de jaren 1940 temperde het enthousiasme voor fagenonderzoek en -therapie verder. Fagetherapie bleef echter een actief onderzoeks- en ontwikkelingsgebied in de voormalige USSR, Polen en in mindere mate in India. Opmerkelijk is dat onderzoekers in het afgelopen decennium, vanwege de opkomst van multiresistente bacteriën, deze eeuwenoude benadering opnieuw hebben overwogen en fagetherapie hebben beschouwd als een “nieuwe” en potentieel haalbare behandelingsoptie voor moeilijk te behandelen bacteriële ziekteverwekkers.

In dit essay worden de oorsprong van fagetherapie, de biologie en levenscyclus van fagen, evenals een samenvatting van de experimentele en klinische gegevens ter ondersteuning van fagetherapie bij de behandeling van multiresistente (MDR) bacteriële infecties en sepsis besproken. Het blijft afwachten of fagetherapie in de moderne intensive care ooit haar volledige therapeutische potentieel zal bereiken, maar de praktische toepasbaarheid ervan als alternatief voor antibiotica voor de behandeling van menselijke sepsis bij ziekteverwekkers die meerdere antibioticaresistentiegenen dragen, wordt nu serieus overwogen.

Historische achtergrond

Ernest Hanbury Hankin, een Britse bacterioloog die werkzaam was als chemisch onderzoeker en bacterioloog voor de regering van de Verenigde Provincies en de Centrale Provincies van India, toonde in 1896 aan dat de wateren van de Indiase rivieren de Ganges en de Yamuna een biologisch principe bevatten dat culturen van cholera-veroorzakende bacteriën vernietigde. Deze substantie kon Millipore-filters passeren, waarvan bekend is dat ze grotere micro-organismen zoals bacteriën kunnen tegenhouden. Hij publiceerde zijn werk in het Frans in de Annalen van het Pasteur Instituut. Terwijl hij in 1915 de groei van het vacciniavirus op celvrije agarmedia onderzocht, merkte de Britse microbioloog Frederick Twort op dat “zuivere” bacterieculturen geassocieerd kunnen worden met een permeabel filtermateriaal, dat mogelijk bacteriën van een cultuur volledig in granulaat kan afbreken. Dit “filtreerbare agens” werd gedetecteerd in culturen van microkokken geïsoleerd uit vaccinia: materiaal van sommige kolonies dat niet kon worden gesubcultiveerd, was in staat om een nieuwe groei van microkokken te infecteren, en deze toestand kon bijna voor korte tijd worden overgedragen op verse culturen van het micro-organisme voor een onbepaald aantal generaties. Dit transparante materiaal, waarvan werd vastgesteld dat het niet kon groeien zonder bacteriën, werd door Twort beschreven als een ferment dat door het micro-organisme werd uitgescheiden voor een op dat moment onduidelijk doel.

Twee jaar na dit rapport beschreef Félix d’Herelle onafhankelijk een vergelijkbare experimentele bevinding, terwijl hij patiënten onderzocht die leden aan of herstellende waren van bacillaire dysenterie. Hij isoleerde uit de ontlasting van shigellosepatiënten een zogenaamde “anti-Shiga-microbe” door ontlasting te filtreren die 18 uur was geïncubeerd. Dit actieve filtraat kon, indien toegevoegd aan een cultuur of een emulsie van de Shiga-bacillen, een stopzetting van de cultuur, de dood en uiteindelijk de lyse van de bacillen veroorzaken. D’Herelle beschreef zijn ontdekking als een microbe die een “ware” microbe van immuniteit en een obligate bacteriofaag was. Hij demonstreerde ook de activiteit van deze anti-Shiga-microbe door laboratoriumdieren te inoculeren voor de behandeling van shigellose en leek de klinische betekenis van zijn bevinding te bevestigen door ten minste enkele van Kochs postulaten te bevredigen.

Afgezien van de discussie over de herkomst van d’Herelle zelf (sommigen beweren dat hij in Parijs is geboren, terwijl anderen beweren dat hij in Montreal is geboren), werd de aanvankelijke controverse voornamelijk gevoerd door Bordet en zijn collega Gartia aan het Pasteur Instituut in Brussel. Deze auteurs deden concurrerende beweringen over de exacte aard en betekenis van de fundamentele ontdekking. Terwijl Twort, wegens geldgebrek en zijn lidmaatschap van het Royal Army Medical Corps, zijn onderzoek op hetzelfde gebied niet voortzette, introduceerde d’Herelle het gebruik van bacteriofagen in de klinische geneeskunde en publiceerde hij vele niet-gerandomiseerde studies van over de hele wereld. Hij voerde ook behandelingen uit met intraveneuze fagen voor invasieve infecties, en hij vatte al deze bevindingen en observaties samen in 1931. Het eerste gepubliceerde artikel over het klinische gebruik van fagen werd echter in België gepubliceerd door Bruynoghe en Maisin, die bacteriofagen gebruikten voor de behandeling van cutane furunkels en karbunkels door staphylococcus-specifieke fagen te injecteren nabij de basis van de huidzweren. Ze beschreven duidelijke aanwijzingen voor klinische verbetering binnen 48 uur met een vermindering van pijn, zwelling en koorts bij de behandelde patiënten.

In die tijd was de exacte aard van de faag nog niet bekend en bleef het een kwestie van actieve en levendige discussie. Het gebrek aan kennis over de essentiële aard van DNA en RNA als genetische essentie van het leven verhinderde een uitgebreider begrip van de faagbiologie in het begin van de 20e eeuw. In 1938 concludeerde John Northrop uit zijn eigen werk dat bacteriofagen door levende gastheren werden geproduceerd door de generatie van een inert eiwit, dat door een autokatalytische reactie in de actieve faag wordt omgezet.

Verschillende bijdragen van andere onderzoekers ondersteunden echter d’Herelle’s idee dat fagen levende deeltjes of virussen waren, wanneer ze zich in hun gastheercellen repliceren. In 1928 assimileerde Wollman de eigenschappen van fagen met die van genen, wat in 1925 door Bordet en Bail de idee bevestigde dat de reproductiecapaciteit van fagen in bacteriën de insertie van faag-gecodeerd materiaal in de erfelijke eenheden van de gastheermicrobe vereist. Frank Macfarlane, een Australische wetenschapper die in 1960 de Nobelprijs ontving voor zijn werk aan immuniteit, werkte ook aan lysogenie en bevestigde de virale aard van fagen, evenals de aard van hun interacties met bacteriële gastheren. Hij toonde ook aan dat er verschillende soorten fagen bestaan.

Uiteindelijk heeft de uitvinding van de elektronenmicroscoop (EM) de Duitse arts Helmut Ruska in staat gesteld om eerst ronde deeltjes en “sperma-achtige” deeltjes te beschrijven uit een faagsuspensie die aan een bacteriemembraan hechtte. Twee jaar later vatte hij in zijn proefschrift zijn belangrijkste onderzoek naar de aard en biologie van bacteriofagen samen. Een jaar na de eerste beschrijving van fagen met EM introduceerden Luria en Anderson in Camden, New Jersey, verschillende soorten fagen en beschreven hun gemeenschappelijke structuur: een inhomogene ronde kop met een veel dunnere staart, wat het eigenaardige sperma-achtige uiterlijk geeft. Ze beschreven ook de verschillende stadia van bacteriële lyse: met de tijd toenemende adsorptie, uitgebreide bacteriële schade en het verschijnen van een groot aantal nieuw gevormde bacteriofagen.

 

Terwijl fagenonderzoek in de voormalige USSR met de ontwikkeling van het Eliava Instituut in Tbilisi, Georgië, en enkele andere landen zoals Polen (en het bekende Hirszfeld Instituut in Wrocław) nooit werd opgegeven, herontdekte de Engelse literatuur fagetherapie bij dieren in de jaren 1980 en begonnen menselijke proeven in de jaren 2000, met de eerste fase I gerandomiseerde studie gepubliceerd in 2009 in de VS.

In augustus 2004 vond de zogenaamde Faagtop plaats in Key Biscayne, Florida. Meer dan 350 conferentiedeelnemers woonden deze eerste grote internationale bijeenkomst in decennia bij, gewijd aan faagbiologie. Over het algemeen is de faaglitteratuur uitgegroeid tot een van de meest uitgebreide onderwerpen, waardoor bacteriofagen een van de best bestudeerde, aan de wetenschap bekende microben zijn. In de jaren 1958 en 1967 publiceerde Raettig twee bibliografieën met ongeveer 11.358 bronvermeldingen. In 2012 analyseerde Ackerman 30.000 faagpublicaties die tussen 1965 en 2010 waren gepubliceerd. De namen van de eerste auteurs vertegenwoordigen 40 taalgebieden of geografische gebieden en ten minste 70 talen, wat leidt tot de conclusie dat faagdeeltjes over de hele wereld worden bestudeerd (ook al overheersen Engelse en Duitse talen).

 

Soorten fagen en faagbiologie

Meer dan 6000 verschillende bacteriofagen zijn ontdekt en morfologisch beschreven, waaronder 6196 bacteriële en 88 archaeale virussen. De overgrote meerderheid van deze virussen is verzwakt, terwijl een klein deel polyedrisch, filamenteus of pleomorf is. Ze kunnen worden geclassificeerd op basis van hun morfologie, hun genetische inhoud (DNA versus RNA), hun specifieke gastheer (bijvoorbeeld de Staphylococcus-faagfamilie, de Pseudomonas-faagfamilie, enz.), de plaats waar ze leven (marien virus versus andere habitats), en hun levenscyclus (zie hieronder). In de loop der tijd zijn nieuwe classificatieformaten voorgesteld, en afkortingen voor deze virussen zijn in 2000 door Fauquet en Pringle voorgesteld.

Als obligate intracellulaire parasiet van een bacteriecel vertonen fagen verschillende levenscycli binnen de bacteriële gastheer: lytische, lysogene, pseudolysogene en chronische infectie.

Bij fagetherapie lag de nadruk op lytische fagen, die voornamelijk vertegenwoordigd zijn in drie families van de orde Caudovirales: de Myoviridae, de Siphoviridae en de Podoviridae. Er zijn ook enkele rapporten over toepassingen van kubische fagen en filamenteuze fagen. De algemene beschrijving van deze fagen kan als volgt worden samengevat: Het genetisch materiaal is ingesloten in een eiwitmantel of capside, dat de vorm heeft van een icosaëder; deze kop is via een kraag verbonden met de staart, die al dan niet contractiel kan zijn, en waarvan het distale uiteinde in contact staat met staartvezels, waarvan de uiteinden bevestigingsplaatsen op receptoren van het bacteriële celoppervlak herkennen.

Ongeacht het type cyclus van een faagleven, is de eerste stap de binding aan receptoren van de bacteriële celwand, voordat fagen de bacteriën kunnen binnendringen. Dit specifieke proces beïnvloedt het spectrum van mogelijke interacties tussen fagen en bacteriën. De bacteriofaag λ interageert bijvoorbeeld alleen met de LamB-receptor van E. coli. De ruimtelijk-temporele dynamiek heeft aangetoond dat deze gebeurtenis van groot belang is voor een succesvolle bacteriële invasie. Sommige fagen zijn ook in staat om specifieke enzymen (zoals hydrolasen of polysaccharidasen en polysaccharidelyasen) te synthetiseren, die exopolysaccharide-structuurkapsels kunnen afbreken voordat ze kunnen interageren met hun specifieke receptor.

Dit is het geval bij sommige fagen die interageren met stammen van E. coli, V. cholerae, P. aeruginosa, E. agglomerans en P. putida. Deze enzymen zijn van potentieel belang voor hun therapeutische implicaties en bevinden zich momenteel in preklinische ontwikkeling.

 

Bij binding aan zijn specifieke receptor induceren fagen een porie in de bacteriële celwand en injecteren ze hun DNA in de cel, terwijl het virale capside buiten de bacteriën blijft. Hierop volgt de expressie van vroege faaggenen, die in het geval van lytische fagen de bacteriële synthesemachinerie omleiden naar de reproductie van virale nucleïnezuren en eiwitten. Het assembleren en verpakken van fagen wordt dan waargenomen, voordat de lyse van de bacteriecellen en de afgifte van faagnageslacht optreden. De late enzymen van de fagen, zoals lysinen, holinen en remmers van de mureïnesynthese, worden vervolgens ingezet voor de virion-burst in de extracellulaire omgeving. Het aantal vrijgekomen virusdeeltjes of de grootte van de bursts varieert sterk, afhankelijk van de faag, de toestand van de bacteriële gastheer en andere omgevingsfactoren, zoals de voedingscomponenten rondom de gastheer.

In de lysogene cyclus voegen de zogenaamde gematigde fagen hun genetische inhoud (de profaag) in de chromosomen van de bacteriën in, waar ze gedurende langere tijd inactief blijven en als onderdeel van het bacteriële chromosoom worden gerepliceerd. Er is dus geen zelfreplicatie. Dit profaag-DNA wordt verticaal samen met het gehele bacteriële genoom aan hun nakomelingen doorgegeven, totdat de lysecyclus wordt geïnduceerd.

Tijdens de inductie kan lysogene faag af en toe genetisch gastheermateriaal, grenzend aan de insertieplaats op het chromosoom, van de ene bacterie naar de andere overbrengen, een fenomeen dat transductie wordt genoemd. Het feit dat fagen van groot belang zijn voor de evolutie van het bacteriële genoom is al jaren bekend, en Brussow beschreef bacteriofagen zelfs als middel voor laterale genoverdracht.

Dit proces kan de overdracht van genen bevorderen die van selectief voordeel zijn voor de bacteriële gastheer, inclusief antibioticaresistentiegenen; hetzelfde proces zou echter therapeutisch kunnen worden benut door fagen te gebruiken om genen over te dragen die bacteriën gevoeliger maken voor sommige antibiotica. Lu en Collins toonden in vitro inderdaad een verhoogde gevoeligheid van E. coli voor antibiotica aan door zich te richten op de mechanismen van DNA-reparatie door injectie van een specifiek gen dat leidde tot overexpressie van een eiwit dat dit systeem remt. De geninsertie werd bereikt door een specifieke en gemodificeerde bacteriofaag M13. Interessant is dat ze dezelfde techniek ook gebruikten bij muizen die intraperitoneaal waren geïnfecteerd met E. coli. De overleving was verhoogd bij muizen die gelijktijdig werden behandeld met antibiotica en gemodificeerde fagen. Deze benadering werd door andere auteurs vergelijkbaar bevonden met de algemene benadering van fagetherapie, die leidt tot directe doding van bacteriën.

 

Een andere benadering is het omkeren van de resistentie tegen ziekteverwekkers door specifieke genen te injecteren voor een sensibilisatiecassette die op dominante wijze gevoeligheid verleent. Dit werd recentelijk aangetoond door Edgar en collega’s, die in staat waren om resistente bacteriën gevoelig te maken voor streptomycine en nalidixinezuur.

Ten slotte treedt chronische infectie op wanneer de bacterie wordt geïnfecteerd door lysogene fagen die vervolgens muteren en het vermogen verliezen om een lytische replicatiecyclus te initiëren. Het faag-DNA wordt een nieuw deel van het bacteriële chromosoom en wordt een langdurige profaagsequentie.

 

Waarom hebben we fagetherapie nodig?

In de afgelopen twee of drie decennia is de wijdverspreide opkomst en verspreiding van antibioticaresistente bacteriën over de hele wereld een grote therapeutische uitdaging geworden.

MRSA-infecties werden bijvoorbeeld in de VS gemeld met een incidentie van ongeveer 100.000 ernstige infecties in 2005, wat leidde tot 20.000 sterfgevallen.

De beperkte therapeutische opties voor de behandeling van de belangrijkste multiresistente bacteriën (MDR), bekend onder de afkorting ESKAPE-pathogenen (voor Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa en Enterobacter spp.), zijn inmiddels op veel intensive care-afdelingen wereldwijd een dreigende gezondheidscrisis geworden.

De behandeling van patiënten met MDR-pathogenen bleek door Morales et al. de totale zorgkosten te verhogen en de duur van de ziekenhuisopname te verlengen.

In alle gezondheidsberoepen bestaat een ethische noodzaak om alles in het werk te stellen om de werkzaamheid van antibiotica te behouden en te erkennen dat deze kostbare hulpbron wordt verspild door het vaak onnodige en ongepaste gebruik van antibiotica, waardoor de verwerving en verspreiding van antibioticaresistentiegenen wordt bevorderd. Antibioticaresistentie wordt nu beschouwd als een noodsituatie in de gezondheidszorg en velen eisen de ontwikkeling van nieuwe middelen om deze te bestrijden. Antibiotica worden echter niet ontwikkeld op basis van direct nut voor het publiek, maar op basis van criteria van de vrije markt. Ondanks de oproep tot de ontwikkeling van nieuwe antibiotica in de Europese Unie (EU) en in de Verenigde Staten (VS),

Verklaring van de World Medical Association over resistentie tegen antimicrobiële middelen www.wma.net/e/policy/a19htm ontbreekt het aan nieuwe antibiotica in de ontwikkelingspijplijn.

Een volledig nieuwe, niet-antibiotische benadering voor de behandeling van bacteriële ziekteverwekkers is zeker nodig. De hernieuwde toepassing van fagetherapie zou een welkome alternatief kunnen zijn voor antimicrobiële chemotherapie in deze fase van de voortschrijdende verspreiding van bacteriële MDR-ziekteverwekkers met een gebrek aan nieuwe antibiotica om deze ziekteverwekkers te bestrijden.

Bovendien overstijgt de behoefte aan faagtoepassingen zeker het gebruik bij menselijke infecties. Het gebruik van bacteriofagen is inderdaad beschreven in verschillende situaties, waaronder (maar niet beperkt tot): voedselveiligheid,

veterinaire toepassingen en klinische diagnostische toepassingen zoals detectie en typering van bacteriën bij menselijke infecties.

 

Mogelijke voordelen van fagetherapie

Bacteriofagen zijn natuurlijke antibiotica die in staat zijn om bacteriepopulaties te reguleren door inductie van bacteriële lyse. Ze zijn actief tegen grampositieve, evenals gramnegatieve bacteriën.

Aangezien het werkingsmechanisme van faaglyse volledig verschilt van dat van antibiotica, blijft de activiteit behouden tegen bacteriën die meerdere mechanismen van antibioticaresistentie vertonen.

Vanwege hun specificiteit heeft fagetherapie een smal antibacterieel spectrum met een effect dat beperkt is tot een enkele soort of in sommige gevallen tot een enkele stam binnen een soort. Dit beperkt de “druk” en de ernstige nevenschade die optreedt bij omstander, niet-doelgerichte bacteriën door antibiotica. Het gehele microbioom van de patiënt wordt door antibiotica veranderd, niet alleen het beoogde doelpathogeen. Chibani-Chennoufi et al. toonden na orale toediening van een tegen E. coli gerichte fagetherapie slechts geringe effecten op de darmmicrobiota bij muizen. Het behoud van een groot deel van het bestaande microbioom tijdens fagetherapie werd bevestigd in zorgvuldige microbiële onderzoeken bij volwassen gezonde vrijwilligers die een 9-fagencocktail hadden ingenomen.

Fagetherapie voorkomt ook de mogelijke overgroei van secundaire ziekteverwekkers.

Aangezien er momenteel geen grote, gerandomiseerde, gecontroleerde studies beschikbaar zijn, is het moeilijk om de bijwerkingen en hun mogelijke gevolgen te beoordelen. Op basis van de rapporten uit Polen en de voormalige Sovjet-Unie lijkt fagetherapie geen significante nadelige effecten te hebben. Het feit dat bacteriofagen alleen interageren met bacteriële cellen en zoogdiercellen niet verstoren, zou mogelijk het gebrek aan schadelijke bijwerkingen kunnen verklaren. Onderrapportage zou een andere verklaring kunnen zijn. De uitstekende verdraagbaarheid van faagbehandeling is echter aangetoond in preklinische studies bij verschillende diermodellen en in verschillende observationele studies bij patiënten en gezonde proefpersonen. Bij systemische toediening treedt een brede verspreiding van fagen op, inclusief het vermogen om de bloed-hersenbarrière te passeren, waardoor deze middelen kunnen worden gebruikt bij infecties van het centrale zenuwstelsel.

Interessant is dat ten minste enkele fagen ook het vermogen vertonen om bacteriële biofilms te vernietigen.

Fagetherapie kan een invloed hebben op de ontstekingsreactie op een infectie. Bij 51 patiënten met verschillende langdurige suppuratieve infecties werd de TNFα-afgifte in vivo en in vitro na stimulatie met LPS afgezwakt op basis van het initiële patroon van de TNFα-serumspiegel. De afgifte van IL-6 was in vivo alleen significant verminderd. C-reactief proteïne en leukocytenaantal werden in deze patiëntenpopulatie aanvankelijk niet beïnvloed, terwijl ze tussen dag 9 en dag 32 significant afnamen bij 37 patiënten die orale fagetherapie kregen tegen osteomyelitis, gewrichtsprothese-infectie, huid- en weke deleninfecties en in één geval longinfectie.

Dit was een observationele studie zonder controlegroep en moet daarom voorzichtig worden geïnterpreteerd. In een recentere observatie werd CRP alleen beïnvloed bij patiënten wier initiële CRP-serumspiegel boven de 10 mg/dl lag.

Witte bloedcellen kunnen ook worden beïnvloed door fagetherapie: bij patiënten na 3 weken en 3 maanden therapie werden verhoogde neutrofiele voorlopers en een verlaagde fagocytose-index voor Staphylococcus aureus waargenomen in vergelijking met gezonde donoren. Recentelijk is een uitgebreid overzicht van de verandering in immuunresponsen bij fagetherapie gepubliceerd.

Ten slotte zijn de economische aspecten van fagetherapie veelbelovend. Ondanks het feit dat de behandelingsduur significant werd verlengd, waren de kosten van fagetherapie lager dan die van een conventionele antibioticabehandeling, zoals aangetoond bij 6 patiënten met verschillende stafylokokkeninfecties, waaronder methicilline-resistente Staphylococcus aureus.

Bovenal is het feit dat bacteriofagen een verbeterde werkzaamheid kunnen vertonen in vergelijking met antibiotica de grootste hoop voor de toekomst. Smith en collega’s toonden deze bevinding voor het eerst aan in de vroege jaren 1980, toen ze een dodelijke E. coli-infectie bij muizen veroorzaakten met een hoogvirulente stam die een K1-polysaccharidekapsel tot expressie bracht.

Een enkele intramusculaire dosis anti-K1-fagen was even effectief als meerdere streptomycine-injecties en was superieur aan meerdere intramusculaire doses tetracycline, ampicilline, chlooramfenicol of trimethoprim bij het genezen van de dieren. Voor zover wij weten, is deze observatie bij menselijke infecties nooit bevestigd.

 

Mogelijke beperkingen en nadelen van fagetherapie

Ondanks alle hierboven samengevatte voordelen zijn we nog ver verwijderd van het bestempelen van fagen als een “wondermiddel” voor de behandeling van elke vorm van infectie. De optimale dosis, de toedieningsweg, de frequentie en de duur van de behandeling moeten nog worden vastgesteld voordat grootschalige klinische studies worden overwogen.

Het grootste nadeel van fagetherapie is de noodzaak om de exacte etiologische micro-organisme dat de infectie veroorzaakt snel en nauwkeurig te bepalen. De exquise specificiteit van fagetherapie tegen specifieke ziekteverwekkers is een groot voordeel, maar ook een last. Een klinisch monster moet worden geïsoleerd en gekweekt met behulp van standaard microbiologische diagnostische procedures om de ziekteverwekker te identificeren, voordat een specifieke bacteriofaagoplossing kan worden gedefinieerd en later aan de patiënt kan worden toegediend. Innovaties in snelle bacteriële diagnostiek met genomische methoden of het gebruik van massaspectrometrie zouden uitkomst kunnen bieden. In de meeste laboratoria voor klinische microbiologie en in zorginstellingen met beperkte middelen is dit echter een tijdrovend proces.

Dit probleem zou mogelijk kunnen worden opgelost door het gebruik van kant-en-klare faagcocktails. De selectie van potente fagen uit een beschikbare collectie na faagtypering van de geïsoleerde bacteriën definieert de zogenaamde samengestelde faagcocktailbehandeling. Als er uiteindelijk geen actief, bestaand faagpreparaat tegen een ernstig pathogeen aanwezig is, kan het direct uit de omgeving worden geïsoleerd voordat het voor toepassing wordt voorbereid.

Bijvoorbeeld, tijdens de recente uitbraak van E. coli O104:H4 in Duitsland werden actieve lytische fagen gevonden in de collectie van het Eliava Instituut (Georgië) en in het afvalwater van het Militair Ziekenhuis in Brussel, België.

De keuze van de bacteriofaag voor therapie is beperkt tot lytische fagen.

Lysogene fagen induceren inderdaad een vertraagde lyse, waardoor de toepassing van deze fagen bij een acute infectie wordt voorkomen. Hoewel gestandaardiseerde methoden voor de productie van faagcocktails bestaan, zijn er geen duidelijke officiële richtlijnen.

De stabiliteit van virussen met betrekking tot hun gevoeligheid voor verschillende externe en fysieke factoren is recentelijk beoordeeld en zou verantwoordelijk kunnen zijn voor enkele moeilijkheden bij de productie van stabiele oplossingen.

Een andere zorg bij fagetherapie is het potentiële vermogen van bacteriofagen om DNA van de ene bacterie naar de andere over te dragen. Deze overdracht van genetisch materiaal, of transductie, zou verantwoordelijk kunnen zijn voor de overdracht van pathogeniciteitsdeterminanten en virulentiefactoren, wat zou kunnen leiden tot de ontwikkeling van een nieuwe microbe of nog resistentere bacteriën.

Daarom zou de voorkeur uitgaan naar het gebruik van fagen die niet in staat zijn om extra gastheer-DNA te verpakken, of fagen die het gastheer-DNA gebruiken voor de synthese van hun eigen DNA. Deze techniek is reeds succesvol toegepast in fagetherapie.

Het genoom van veel fagen is ontcijferd en elke maand zijn er rapporten over nieuw geïdentificeerde gensequenties. We zijn echter nog ver verwijderd van het kennen van het gen van elke soort faag en de functie van veel van deze genen is nog onbekend. De ORFan-genen die in sommige fagen zijn gevonden, vertonen bijvoorbeeld geen gelijkenis met enig ander gen in de gendatabank. De rol van deze genen bij het bevorderen van schadelijke bijwerkingen moet nog worden opgehelderd.

Aan het einde van hun antibacteriële werking induceren lytische fagen de lyse van bacteriën en geven ze verschillende bacteriële substanties vrij, zoals endotoxine (LPS) van gramnegatieve bacteriën. Dit kan verantwoordelijk zijn voor verschillende bijwerkingen op de gastheer, zoals de ontwikkeling van een ontstekingscascade die leidt tot meervoudig orgaanfalen. Dit potentiële probleem betreft echter momenteel beschikbare snel bactericide antibiotica.

Aangezien het virussen zijn, kunnen bacteriofagen door het immuunsysteem van de patiënt als een potentiële indringer worden beschouwd en daarom snel uit de systemische circulatie worden geëlimineerd door de verwijdering van het reticulo-endotheliale systeem, voordat ze zich in de milt of de lever kunnen ophopen of kunnen worden geïnactiveerd door de adaptieve immuunafweermechanismen. Dit kan leiden tot verminderde werkzaamheid bij langdurig of herhaald gebruik.

Ten slotte zou de ontwikkeling van resistentiemechanismen door de bacteriële gastheer, veroorzaakt door mutatie en selectie of door de verwerving van gematigde fagen, kunnen leiden tot een verminderde werkzaamheid van fagen. Er zijn ten minste 4 mechanismen die betrokken kunnen zijn bij bacteriële resistentie tegen een specifieke faag. Verlies of gebrek aan receptor, structurele modificatie en/of maskering van de receptor voorkomen de faagadsorptie aan de bacteriën en voorkomen het verdere vermogen om nieuwe fagen te produceren. Receptorverlies kan optreden wanneer de celoppervlaktesamenstelling wordt gewijzigd, zoals is aangetoond voor Bordetella spp.

Voor het E. coli-eiwit TraT is een structurele modificatie vastgesteld, die de conformatie van OmpA (Outer-Membrane Protein A), de receptor voor T-Even-achtige fagen, wijzigt. Secretie van verschillende moleculen (zoals exopolysaccharide van Pseudomonas spp. of glycoconjugaten van Enterobacteriaceae) kan de receptor maskeren, maar fagen kunnen dit tegengaan door de selectie van een nieuwe receptor of door de secretie van het exopolysaccharide-afbrekende enzym.

De andere resistentiemechanismen omvatten het voorkomen van faag-DNA-integratie door het Superinfection Exclusion System (Sie), de afbraak van faag-DNA door het Restrictie-Modificatie-afweersysteem of door Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) en de blokkering van faagreplicatie en -transcriptie, translatie of virionassemblage door het Abortive-Infection-systeem.

Gelukkig is de frequentie van resistentie in vivo tijdens fagetherapie tot nu toe naar verluidt laag, in tegenstelling tot de waargenomen in vitro resistentieanalyses. Bovendien zou de isolatie van nieuwe actieve fagen uit de omgeving of de voortschrijdende isolatie van “aangepaste” fagen een nieuwe behandelingsmogelijkheid kunnen bieden.

In de meeste landen wordt fagetherapie niet gedekt door de wettelijke ziektekostenverzekering, wat voor sommige patiënten een potentieel financieel probleem vormt. Er zijn enkele uitzonderingen. De Zwitserse autoriteiten hebben besloten de kosten voor complementaire geneeskunde voor een periode van 6 jaar te vergoeden, terwijl de werkzaamheid wordt beoordeeld, en de president van de stad Wrocław (waar het Hirszfeld Instituut zich bevindt), Polen, heeft een programma opgesteld om de kosten van fagetherapie voor de inwoners van de stad te dekken; 2 voorbeelden om te volgen volgens Myedzybrodzki.

Aangezien bacteriële virussen momenteel niet als geneesmiddelen worden erkend, zijn de huidige farmacologische voorschriften, definities en normen in Europa niet adequaat aangepast aan faagpreparaten. Om deze reden hebben een Belgische onderzoeksgroep en enkele leden van het Pasteur Instituut in Parijs de PHAGE (voor Phages of Human Application Group Europe) ontwikkeld, een internationale non-profitorganisatie, met als doel een specifiek kader voor het gebruik van bacteriofagen te ontwikkelen.

De regelgevende goedkeuring blijft een andere hindernis. Naast veiligheidsproblemen hebben noch de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) noch het Europees Geneesmiddelenbureau een goedkeuringsprocedure die gemakkelijk rekening kan houden met de voortdurend veranderende faagcombinaties die bedrijven moeten ontwikkelen om de ontwikkeling van MDR-bacteriën voor te blijven.

Experimentele gegevens met fagetherapie

Veel experimentele gegevens zijn verzameld sinds de twee baanbrekende studies van Smith en Huggins, waarin begin jaren 80 de potentiële rol van bacteriofagen bij de bestrijding van systemische infecties en enteritis bij muizen, kalveren, biggen en lammeren werd aangetoond.

Muizen zijn uitgebreid onderzocht als proefdieren, maar er zijn ook rapporten over fagetherapieën in laboratoriummodellen van infecties bij ratten, kippen, konijnen, kalveren en lammeren. Verschillende infectiemodellen zijn geëvalueerd, zoals de intraperitoneale injectie van levende bacteriën, wat leidde tot een systemische infectie met bacteriëmie, de intramusculaire injectie van bacteriën, een infectie van het centrale zenuwstelsel, een longinfectie, leverabcessen, een enteritis, een urineweginfectie, een botinfectie, huid- en wondinfecties. Tot de in deze modellen gebruikte bacteriën behoorden E. coli, MDR-bacteriën (Pseudomonas aeruginosa, ESBL-producerende E. coli en K. pneumoniae, Vancomycine-resistente Enterococcus faecium), Staphylococcus aureus en Chronobacter turicensis. Sommige stammen werden rechtstreeks van patiënten geïsoleerd. De geteste toedieningsprocedure van fagetherapie omvat de intraperitoneale injectie, de orale of intragastrische toediening, topische, subcutane en intramusculaire injecties en de intranasale toediening. Hoewel in sommige studies de toediening van fagen als profylactische maatregel werd beschouwd, werd de behandeling doorgaans als een enkele dosis na de bacteriële uitdaging toegediend en in sommige studies werd de toediening uitgesteld totdat de dieren symptomen van diarree-infectie of duidelijke tekenen van een ernstige infectie vertoonden.

Over het algemeen toonden deze studies positieve effecten op de mortaliteit onder fagetherapie en in 3 studies, waarin de mortaliteit werd beoordeeld, waren de resultaten significant beter dan die van antibiotica die als vergelijkingspreparaten werden gebruikt.

In een studie van het geïnfecteerde botmodel bij ratten verminderde de gecombineerde antibioticum-bacteriofaagbehandeling de kwantitatieve kweek van de geïnfecteerde plaats aan het einde van de studie significant in vergelijking met beide behandelingsmodaliteiten afzonderlijk.

Reeds beschreven menselijke toepassingen

In het eerste rapport over de toepassing van bacteriofagen bij mensen werd de werkzaamheid bij stafylokokken-huidfurunkels beschreven en vatte d’Herelle in 1931 al zijn klinische werkzaamheden samen. In de jaren 1930 verscheen een groot aantal publicaties en een volledige monografie van het tijdschrift La Médicine behandelde faagtoepassingen bij menselijke aandoeningen. De behandeling van tyfus, Shigella en Salmonella spp.-gerelateerde colitis, peritonitis, huidinfecties, chirurgische infecties (voornamelijk abcessen van verschillende lokalisaties), septikemie, urineweginfecties en otolaryngologische infecties (externe otitis en neusfurunkels) werden beschreven.

Zoals reeds beschreven, nam het enthousiasme voor de faagtherapie in de westerse landen in de jaren 1930 echter af als gevolg van de rapporten van Eaton en collega’s en ook als gevolg van de ontdekking en het eenvoudige gebruik van antibiotica. Het gebruik van bacteriofagen werd voortgezet in de oosterse landen, en in de loop van de tijd werden talrijke rapporten gepubliceerd, voornamelijk in Polen en Georgië (voormalige USSR). Het gebruik van niet-Engelstalige literatuur (voornamelijk Russisch en Pools) verklaart waarschijnlijk het feit dat deze rapporten beperkt bleven tot het land van herkomst van de auteurs. Een samenvatting van deze literatuur werd onlangs gepubliceerd door verschillende auteurs. Wij moeten echter opmerken dat de meeste gepubliceerde gegevens afkomstig zijn uit niet-gerandomiseerde, ongecontroleerde studies.

De eerste fase-I-gecontroleerde gerandomiseerde studie die in de Verenigde Staten werd uitgevoerd, werd in 2009 gepubliceerd. Deze evalueerde de veiligheid van een cocktail van fagen gericht tegen E. coli, S. aureus en Pseudomonas aeruginosa bij 42 patiënten met chronische veneuze beenzweren. De studie kon geen positieve resultaten aantonen zoals genezingspercentage of -frequentie, maar de auteurs stelden geen bijwerkingen vast die verband hielden met de behandeling. Een andere gerandomiseerde studie werd uitgevoerd in het Verenigd Koninkrijk en onderzocht de werkzaamheid van een toepassing van een oplossing met 6 bacteriofagen in de oren van patiënten met chronische door Pseudomonas aeruginosa veroorzaakte otitis. Het aantal kolonies van P. aeruginosa in de behandelde groep nam in deze goed uitgevoerde, dubbelblinde, placebogecontroleerde studie significant af, terwijl verschillende subjectieve klinische indicatoren bij deze patiënten verbeterden. De patiënten rapporteerden een lagere intensiteit van symptomen zoals ongemak, jeuk, vochtigheid en onaangename geur. Evenzo rapporteerden de artsen die verantwoordelijk waren voor de patiënten (en geblindeerd waren voor de toegewezen behandeling) verminderde klinische waarnemingen zoals erytheem/ontsteking, ulceraties/granulaties/poliepen en geuren. Er werden geen bijwerkingen gemeld.

Onlangs werd een kleine fase-I-studie uitgevoerd met 9 patiënten die werden behandeld in het Burn Wound Center van het Queen Astrid Military Hospital in Brussel, België. De patiënten werden lokaal behandeld met de BFC-1-fagencocktail, die 3 lytische fagen bevatte: een myovirus, een podovirus gericht tegen Pseudomonas aeruginosa en een myovirus gericht tegen Staphylococcus aureus. Een groot verbrand gedeelte werd blootgesteld aan een enkele spraytoepassing, terwijl een verwijderd deel van de wond als controle diende. Hoewel de volledige resultaten nog moeten worden gepubliceerd, werd geen veiligheidsprobleem gemeld.

Ten slotte bevestigde een gerandomiseerde gecontroleerde studie de veiligheid van een oraal toegediende fagenoplossing bij gezonde, niet-geïnfecteerde patiënten.

Conclusies

Bacteriofagen zijn een mogelijk alternatief instrument voor de behandeling van bacteriële infecties, inclusief die welke worden veroorzaakt door MDR-pathogenen. Faagtherapie vertoont inderdaad verschillende voordelen en er worden slechts weinig ongewenste voorvallen gemeld, maar onderrapportage kan niet worden uitgesloten. Er zijn echter verdere goed uitgevoerde studies nodig om de rol en veiligheid van faagtherapie in de dagelijkse klinische praktijk te definiëren voor de behandeling van patiënten met verschillende infecties.

Bovendien heeft het directe gebruik van door fagen gecodeerde eiwitten zoals endolysines, exopolysaccharidasen en holines zich bewezen als veelbelovend alternatief voor antibacteriële producten. Dit onderwerp zou echter buiten het bestek van deze beoordeling vallen.

 

Machinevertaling van de bron: https://doi.org/10.4161/viru.25991

Xavier Wittebole, Sophie De Roock & Steven M Opal