“Con l’introduzione del nuovo Bacteriophage Journal all’inizio del 2011, Alexander Sulakvelidze ha definito i batteriofagi come ‘gli organismi più ubiquitari della Terra, che svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell’equilibrio microbico su questo pianeta. In effetti, i batteriofagi, o fagi, si trovano ovunque sia presente il loro ospite batterico. È stato rilevato che la popolazione di fagi nei sistemi idrici è compresa tra 10^4 e 10^8 virioni per ml e circa 10^9 virioni per g nel suolo.’” . FEMS Microbiol, con una stima di 10^32 batteriofagi complessivi sul pianeta.
Batteriofagi: una valutazione del loro ruolo nel trattamento delle infezioni batteriche. I fagi, descritti quasi un secolo fa da William Twort e poco dopo scoperti indipendentemente da Félix d’Herelle (considerato da molti il fondatore dei batteriofagi e della loro importanza terapeutica: la terapia fagica), sono piccoli virus in grado di uccidere i batteri. Non influenzano le linee cellulari di altri organismi. Per via della specificità degli ospiti cellulari bersaglio, l’uso dei fagi è stato proposto fin dalla loro introduzione come terapia per il trattamento di infezioni acute e croniche, con successi iniziali descritti per primi in dermatologia, oftalmologia, urologia, stomatologia, pediatria, ORL e chirurgia.
L’entusiasmo iniziale per la terapia fagica nel trattamento delle malattie batteriche, nell’epoca precedente alla terapia antibiotica, era comprensibilmente enorme. In effetti, l’unica terapia disponibile negli anni ’20 e ’30 era la sieroterapia per patogeni selezionati come pneumococchi e difterite. L’uso dei batteriofagi fu persino descritto con grande interesse quando il protagonista del romanzo Arrowsmith di Sinclair Lewis, vincitore del Premio Pulitzer, utilizzò questo trattamento per combattere un’epidemia di peste bubbonica su un’isola dei Caraibi.
Tuttavia, questo concetto di uso terapeutico dei fagi per trattare le infezioni batteriche fu fin dall’inizio molto controverso e non venne generalmente accettato né dal pubblico né dalla comunità medica. I primi studi furono spesso criticati per la mancanza di controlli adeguati e per risultati incoerenti. La scarsa riproducibilità e i numerosi risultati contraddittori ottenuti nei diversi studi pubblicati portarono alla conclusione che le evidenze sul valore terapeutico dei filtrati litici erano in gran parte discordanti e poco convincenti, e vennero inoltre raccomandate ulteriori ricerche per confermarne i presunti benefici. L’avvento dell’era della chemioterapia antibiotica, con l’introduzione dei sulfamidici negli anni ’30 e successivamente della penicillina negli anni ’40, smorzò ulteriormente l’entusiasmo per la ricerca e la terapia con fagi. La terapia fagica rimase però un ambito attivo di ricerca e sviluppo nell’ex URSS, in Polonia e, in misura minore, in India. È significativo che, negli ultimi dieci anni, a causa dell’emergere di batteri multiresistenti, i ricercatori abbiano rivalutato questo approccio secolare e considerato la terapia fagica come un’opzione di trattamento “nuova” e potenzialmente praticabile per patogeni batterici difficili da trattare.
In questo articolo si discutono le origini della terapia fagica, la biologia e il ciclo vitale dei fagi, nonché una sintesi dei dati sperimentali e clinici a supporto della terapia fagica nel trattamento di infezioni batteriche multiresistenti (MDR) e della sepsi. Resta da vedere se la terapia fagica riuscirà mai a esprimere tutto il suo potenziale terapeutico nella moderna terapia intensiva, ma la sua applicabilità pratica come alternativa agli antibiotici per il trattamento della sepsi umana causata da patogeni che portano più geni di resistenza agli antibiotici è ora seriamente presa in considerazione.
Contesto storico
Ernest Hanbury Hankin, batteriologo britannico che lavorava come analista chimico e batteriologo per il governo delle Province Unite e delle Province Centrali dell’India, dimostrò nel 1896 che le acque dei fiumi indiani Ganga e Yamuna contenevano un principio biologico in grado di distruggere colture di batteri responsabili del colera. Questa sostanza poteva attraversare filtri Millipore, noti per trattenere microrganismi più grandi come i batteri. Pubblicò il suo lavoro in francese negli Annales de l’Institut Pasteur. Nel 1915, mentre studiava la crescita del virus Vaccinia su terreni di agar privi di cellule, il microbiologo britannico Frederick Twort osservò che colture batteriche “pure” potevano essere associate a un materiale filtrante permeabile che poteva far sì che i batteri di una coltura venissero completamente disgregati in granuli. Questo “agente filtrabile” fu rilevato in colture di micrococchi isolati da Vaccinia: materiale di alcune colonie, che non poteva essere subcoltivato, era in grado di infettare una nuova crescita di micrococchi e questa condizione poteva essere trasferita per un numero quasi indefinito di generazioni, per breve tempo, a colture fresche del microrganismo. Questo materiale trasparente, che risultò incapace di crescere senza batteri, fu descritto da Twort come un fermento secreto dal microrganismo per uno scopo allora non chiaro.
Due anni dopo questo rapporto, Félix d’Herelle descrisse indipendentemente un risultato sperimentale simile mentre studiava pazienti affetti da dissenteria bacillare o in fase di recupero. Isolò dalle feci di pazienti con shigellosi una cosiddetta “microba anti-Shiga”, filtrando feci incubate per 18 ore. Questo filtrato attivo, se aggiunto a una coltura o a un’emulsione di bacilli Shiga, poteva causare l’arresto della crescita, la morte e infine la lisi dei bacilli. D’Herelle descrisse la sua scoperta come un microbo che era un “vero” microbo dell’immunità e un batteriofago obbligato. Dimostrò anche l’attività di questo microbo anti-Shiga inoculando animali da laboratorio per trattare la shigellosi e sembrò confermare la rilevanza clinica del suo riscontro soddisfacendo almeno alcuni dei postulati di Koch.
Al di là della discussione sulle origini di d’Herelle stesso (alcuni indicano Parigi come luogo di nascita, mentre altri sostengono Montreal), la controversia iniziale fu condotta principalmente da Bordet e dal suo collega Gartia all’Institut Pasteur di Bruxelles. Questi autori avanzarono affermazioni concorrenti sulla natura e sul significato esatti della scoperta fondamentale. Mentre Twort, per mancanza di fondi e per la sua appartenenza al Royal Army Medical Corps, non proseguì le ricerche nello stesso ambito, d’Herelle portò l’uso dei batteriofagi nella medicina clinica e pubblicò molti studi non randomizzati da tutto il mondo. Introdusse anche il trattamento con fagi per via endovenosa per infezioni invasive e nel 1931 riassunse tutte queste evidenze e osservazioni. Il primo articolo pubblicato sull’uso clinico dei fagi fu però pubblicato in Belgio da Bruynoghe e Maisin, che usarono batteriofagi per trattare foruncoli e carbonchi cutanei iniettando fagi specifici per stafilococchi vicino alla base dei foruncoli cutanei. Descrissero chiari segni di miglioramento clinico entro 48 ore, con riduzione del dolore, del gonfiore e della febbre nei pazienti trattati.
In quel periodo la natura esatta del fago non era ancora nota e rimase oggetto di un dibattito attivo e vivace. La mancanza di conoscenze sulla natura essenziale di DNA e RNA come essenza genetica della vita impedì una comprensione più completa della biologia dei fagi all’inizio del XX secolo. Nel 1938 John Northrop concluse, sulla base del proprio lavoro, che i batteriofagi venivano prodotti da ospiti viventi tramite la generazione di una proteina inerte che, attraverso una reazione autocatalitica, veniva convertita nel fago attivo.
Tuttavia, diversi contributi di altri ricercatori supportarono l’idea di d’Herelle secondo cui i fagi sono particelle viventi o virus quando si replicano nelle cellule ospiti. Nel 1928 Wollman assimilò le proprietà dei fagi a quelle dei geni. Nel 1925 Bordet e Bail confermarono l’idea che la capacità dei fagi di riprodursi nei batteri richieda l’inserzione di materiale codificato dal fago nelle unità ereditarie del microrganismo ospite. Frank Macfarlane, scienziato australiano che ricevette il Premio Nobel nel 1960 per i suoi lavori sull’immunità, lavorò anche sulla lisogenia e confermò la natura virale dei fagi e il tipo di interazioni con gli ospiti batterici. Dimostrò inoltre che esistono diversi tipi di fagi.
Infine, l’invenzione del microscopio elettronico (ME) permise al medico tedesco Helmut Ruska di descrivere inizialmente particelle rotonde e particelle “a forma di spermatozoo” in una sospensione di fagi aderente a una membrana batterica. Due anni dopo, nella sua tesi, riassunse le principali ricerche sulla natura e la biologia dei batteriofagi. Un anno dopo la prima descrizione dei fagi con il ME, Luria e Anderson a Camden, New Jersey, presentarono diversi tipi di fagi e ne descrissero la struttura comune: una testa rotonda non omogenea con una coda molto più sottile, che conferisce il caratteristico aspetto simile a uno spermatozoo. Descrissero anche le diverse fasi della lisi batterica: adsorbimento crescente nel tempo, danno batterico esteso e comparsa di un gran numero di batteriofagi di nuova formazione.
Mentre la ricerca sui fagi nell’ex URSS, con lo sviluppo dell’Istituto Eliava a Tbilisi, Georgia, e in alcuni altri Paesi come la Polonia (con il noto Istituto Hirszfeld a Breslavia), non fu mai abbandonata, la letteratura in lingua inglese riscoprì la terapia fagica negli animali negli anni ’80 e gli studi sull’uomo iniziarono negli anni 2000, con la prima sperimentazione randomizzata di fase I pubblicata nel 2009 negli Stati Uniti.
Nell’agosto 2004 si tenne a Key Biscayne, in Florida, il cosiddetto “Phage Summit”. Oltre 350 partecipanti presero parte a questo primo grande incontro internazionale dopo decenni, dedicato alla biologia dei fagi. Nel complesso, la letteratura sui fagi è diventata uno dei temi più vasti, rendendo i batteriofagi tra i microbi più studiati conosciuti dalla scienza. Nel 1958 e nel 1967 Raettig pubblicò due bibliografie con circa 11.358 riferimenti. Nel 2012 Ackerman analizzò 30.000 pubblicazioni sui fagi pubblicate tra il 1965 e il 2010. I nomi dei primi autori rappresentano 40 aree linguistiche o geografiche e almeno 70 lingue, portando alla conclusione che le particelle fagiche vengono studiate in tutto il mondo (anche se l’inglese e il tedesco predominano).
Tipi di fagi e biologia dei fagi
Sono stati scoperti e descritti morfologicamente più di 6000 diversi batteriofagi, tra cui 6196 virus batterici e 88 virus archeali. La stragrande maggioranza di questi virus è “a coda”, mentre una piccola parte è poliedrica, filamentosa o pleomorfa. Possono essere classificati in base alla morfologia, al contenuto genetico (DNA vs RNA), all’ospite specifico (per esempio la famiglia dei fagi degli stafilococchi, la famiglia dei fagi di Pseudomonas, ecc.), al luogo in cui vivono (virus marini rispetto ad altri habitat) e al ciclo vitale (vedi sotto). Nel tempo sono stati proposti nuovi formati di classificazione e nel 2000 Fauquet e Pringle hanno proposto abbreviazioni per questi virus.
In quanto parassiti intracellulari obbligati di una cellula batterica, i fagi presentano diversi cicli vitali all’interno dell’ospite batterico: litico, lisogeno, pseudolisogeno e infezione cronica.
Nella terapia fagica, l’interesse principale si è concentrato sui fagi litici, rappresentati soprattutto in tre famiglie dell’ordine Caudovirales: Myoviridae, Siphoviridae e Podoviridae. Esistono anche alcune segnalazioni di applicazioni di fagi cubici e filamentosi. La descrizione generale di questi fagi può essere riassunta come segue: il materiale genetico è contenuto in un involucro proteico o capside, che ha la forma di un icosaedro; questa testa è collegata tramite un collare alla coda, che può essere o meno contrattile, e la cui estremità distale è in contatto con fibre caudali, le cui punte riconoscono siti di attacco su recettori della superficie della cellula batterica.
Indipendentemente dal tipo di ciclo vitale di un fago, il primo passo consiste nel legame ai recettori della parete cellulare batterica, prima che i fagi possano penetrare nei batteri. Questo processo specifico influenza lo spettro delle possibili interazioni tra fagi e batteri. Per esempio, il batteriofago λ interagisce solo con il recettore LamB di E. coli. La dinamica spazio-temporale ha mostrato che questo evento è di grande importanza per una riuscita invasione batterica. Alcuni fagi sono anche in grado di sintetizzare enzimi specifici (come idrolasi o polisaccaridasi e liasi dei polisaccaridi) che possono degradare le capsule di struttura esopolisaccaridica prima di poter interagire con il loro specifico
recettore. È il caso di alcuni fagi che interagiscono con ceppi di E. coli, V. cholerae, P. aeruginosa, E. agglomerans e P. putida. Questi enzimi sono di potenziale interesse per le loro implicazioni terapeutiche e sono attualmente in sviluppo preclinico.
Legandosi al proprio recettore specifico, i fagi inducono un poro nella parete cellulare batterica e iniettano il loro DNA nella cellula, mentre il capside virale rimane all’esterno del batterio. Segue l’espressione dei geni fagici precoci che, nel caso dei fagi litici, dirottano la macchina di sintesi batterica verso la riproduzione di acidi nucleici e proteine virali. Si osservano poi l’assemblaggio e l’impacchettamento dei fagi, prima che avvengano la lisi delle cellule batteriche e il rilascio della progenie fagica. Gli enzimi tardivi dei fagi, come lisine, holine e inibitori della sintesi della mureina, vengono quindi impiegati per il burst dei virioni nell’ambiente extracellulare. Il numero di particelle virali rilasciate, o dimensione del burst, varia notevolmente a seconda del fago, dello stato dell’ospite batterico e di altri fattori ambientali, come i componenti nutritivi presenti attorno all’ospite.
Nel ciclo lisogeno, i cosiddetti fagi temperati inseriscono il loro contenuto genetico (il profago) nei cromosomi dei batteri, dove rimangono silenti per lunghi periodi e vengono replicati come parte del cromosoma batterico. Pertanto non avviene auto-replicazione. Questo DNA profagico viene trasmesso verticalmente ai discendenti insieme all’intero genoma batterico, finché non viene indotto il ciclo litico.
Durante l’induzione, un fago lisogeno può occasionalmente trasferire materiale genetico dell’ospite adiacente al suo sito di inserzione sul cromosoma da un batterio a un altro, un fenomeno noto come trasduzione. In effetti, è noto da anni che i fagi sono di grande importanza per l’evoluzione del genoma batterico, e Brussow ha persino descritto i batteriofagi come un mezzo di trasferimento genico laterale.
Questo processo può favorire il trasferimento di geni che conferiscono un vantaggio selettivo all’ospite batterico, inclusi i geni di resistenza agli antibiotici; tuttavia, lo stesso processo potrebbe essere sfruttato terapeuticamente usando i fagi per trasferire geni che rendono i batteri più sensibili ad alcuni antibiotici. In effetti, Lu e Collins hanno mostrato in vitro un’aumentata sensibilità di E. coli agli antibiotici, intervenendo sui meccanismi di riparazione del DNA tramite l’iniezione di un gene specifico che portava alla sovraespressione di una proteina in grado di inibire questo sistema. L’inserzione genica fu ottenuta tramite un batteriofago M13 specifico e modificato. È interessante notare che usarono la stessa tecnica anche nei topi infettati intraperitonealmente con E. coli. La sopravvivenza aumentò nei topi trattati contemporaneamente con antibiotici e fagi modificati. Questo approccio è stato ritenuto da altri autori simile all’approccio generale della terapia fagica, che porta all’uccisione diretta dei batteri.
Un altro approccio consiste nell’invertire la resistenza dei patogeni iniettando geni specifici per una cassetta di sensibilizzazione che conferisce suscettibilità in modo dominante. Questo è stato mostrato di recente da Edgar e colleghi, che sono riusciti a rendere batteri resistenti sensibili alla streptomicina e all’acido nalidixico.
Infine, l’infezione cronica si verifica quando il batterio viene infettato da fagi lisogeni che successivamente mutano e perdono la capacità di innescare un ciclo replicativo litico. Il DNA fagico diventa una nuova parte del cromosoma batterico e si trasforma in una sequenza profagica a lungo termine.
Perché abbiamo bisogno della terapia fagica?
Negli ultimi due o tre decenni, la comparsa e la diffusione su larga scala di batteri resistenti agli antibiotici in tutto il mondo è diventata una grande sfida terapeutica.
Per esempio, negli Stati Uniti nel 2005 sono state segnalate infezioni da MRSA con un’incidenza di circa 100.000 infezioni gravi, che hanno portato a 20.000 decessi.
Le opzioni terapeutiche limitate per trattare i principali batteri multiresistenti (MDR), noti con l’acronimo patogeni ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa ed Enterobacter spp.), sono ormai diventate in molte terapie intensive nel mondo una crisi sanitaria imminente.
Il trattamento dei pazienti con patogeni MDR, secondo Morales et al., aumenta i costi complessivi dell’assistenza e prolunga la durata della degenza ospedaliera.
In tutte le professioni sanitarie esiste una necessità etica di fare tutto il possibile per preservare l’efficacia degli antibiotici e riconoscere che questa risorsa preziosa viene sprecata dall’uso spesso inutile e inappropriato degli antibiotici, favorendo l’acquisizione e la diffusione di geni di resistenza agli antibiotici. Le resistenze agli antibiotici sono ormai considerate un’emergenza sanitaria e molti chiedono lo sviluppo di nuovi strumenti per contrastarle. Tuttavia, gli antibiotici non vengono sviluppati sulla base del beneficio diretto per la collettività, ma secondo criteri di libero mercato. Nonostante le richieste di sviluppare nuovi antibiotici nell’Unione Europea (UE) e negli Stati Uniti (USA),
Dichiarazione della World Medical Association sulla resistenza agli antimicrobici www.wma.net/e/policy/a19htm: mancano nuovi antibiotici nella pipeline di sviluppo.
È certamente necessario un approccio completamente nuovo, non antibiotico, per trattare i patogeni batterici. La rinnovata applicazione della terapia fagica potrebbe essere una valida alternativa alla chemioterapia antimicrobica in questa fase di progressiva diffusione di patogeni batterici MDR e di carenza di nuovi antibiotici per combatterli.
Inoltre, il bisogno di applicazioni dei fagi supera certamente l’uso nelle infezioni umane. In effetti, l’uso dei batteriofagi è stato descritto in diverse situazioni, tra cui (ma non solo): sicurezza alimentare,
applicazioni veterinarie e applicazioni diagnostiche cliniche come il rilevamento e la tipizzazione dei batteri nelle infezioni umane.
Possibili vantaggi della terapia fagica
I batteriofagi sono antibiotici naturali in grado di regolare le popolazioni batteriche inducendo la lisi batterica. Sono attivi contro batteri gram-positivi e gram-negativi.
Poiché il meccanismo d’azione della lisi fagica è completamente diverso da quello degli antibiotici, l’attività si mantiene anche contro batteri che presentano molteplici meccanismi di resistenza agli antibiotici.
Grazie alla loro specificità, la terapia fagica ha uno spettro antibatterico ristretto, con un’azione limitata a una singola specie o, in alcuni casi, a un singolo ceppo all’interno di una specie. Questo limita la “pressione” e il grave danno collaterale che gli antibiotici causano sui batteri circostanti non bersaglio. Gli antibiotici alterano l’intero microbioma del paziente, non solo il patogeno bersaglio. Chibani-Chennoufi et al. hanno mostrato che, dopo somministrazione orale di una terapia fagica diretta contro E. coli, l’impatto sulla microbiota intestinale nei topi era minimo. La conservazione di gran parte del microbioma esistente durante la terapia fagica è stata confermata in accurate indagini microbiche su volontari adulti sani che avevano assunto un cocktail di 9 fagi.
La terapia fagica evita anche la possibile proliferazione eccessiva di patogeni secondari.
Poiché al momento non sono disponibili grandi studi randomizzati e controllati, è difficile valutare gli effetti collaterali e i loro possibili impatti. Sulla base dei report provenienti dalla Polonia e dall’ex Unione Sovietica, la terapia fagica sembra non avere effetti avversi significativi. Il fatto che i batteriofagi interagiscano solo con cellule batteriche e non interferiscano con le cellule dei mammiferi potrebbe spiegare la mancanza di effetti collaterali dannosi. La sotto-segnalazione potrebbe essere un’altra spiegazione. Tuttavia, l’eccellente tollerabilità del trattamento con fagi è stata dimostrata in studi preclinici su diversi modelli animali e in molteplici studi osservazionali su pazienti e soggetti sani. Con la somministrazione sistemica si osserva un’ampia distribuzione dei fagi, inclusa la capacità di attraversare la barriera emato-encefalica, consentendo l’uso di questi agenti nelle infezioni del sistema nervoso centrale.
È interessante notare che almeno alcuni fagi mostrano anche la capacità di distruggere i biofilm batterici.
La terapia fagica può influenzare la risposta infiammatoria a un’infezione. In 51 pazienti con diverse infezioni suppurative di lunga durata, il rilascio di TNFα in vivo e in vitro dopo stimolazione con LPS è stato attenuato sulla base del pattern iniziale dei livelli sierici di TNFα. Il rilascio di IL-6 è risultato significativamente ridotto solo in vivo. La proteina C-reattiva e la conta leucocitaria non erano inizialmente influenzate in questa popolazione di pazienti, mentre diminuivano in modo significativo tra il giorno 9 e il giorno 32 in 37 pazienti che ricevevano una terapia fagica orale per osteomielite, infezione di protesi articolare, infezioni cutanee e dei tessuti molli e, in un caso, infezione polmonare.
Si trattava di uno studio osservazionale senza gruppo di controllo e va quindi interpretato con cautela. In un’osservazione più recente, la PCR era influenzata solo nei pazienti con livelli sierici iniziali di PCR superiori a 10 mg/dl.
Anche i globuli bianchi possono essere influenzati dalla terapia fagica: nei pazienti, dopo 3 settimane e 3 mesi di terapia, sono stati osservati precursori neutrofili aumentati e un indice di fagocitosi ridotto per Staphylococcus aureus rispetto a donatori sani. Di recente è stata pubblicata un’ampia revisione sulle modifiche delle risposte immunitarie durante la terapia fagica.
Infine, gli aspetti economici della terapia fagica sono promettenti. Nonostante la durata del trattamento sia stata significativamente più lunga, i costi della terapia fagica erano inferiori rispetto a un trattamento antibiotico convenzionale, come mostrato in 6 pazienti con diverse infezioni da stafilococchi, incluso Staphylococcus aureus meticillino-resistente.
Soprattutto, la possibilità che i batteriofagi possano avere un’efficacia superiore rispetto agli antibiotici è la maggiore speranza per il futuro. Smith e colleghi dimostrarono per la prima volta questo risultato all’inizio degli anni ’80, quando indussero nei topi un’infezione letale da E. coli con un ceppo altamente virulento che esprimeva una capsula polisaccaridica K1.
Una singola dose intramuscolare di fagi anti-K1 fu efficace quanto diverse iniezioni di streptomicina e risultò superiore, nel guarire gli animali, a più dosi intramuscolari di tetraciclina, ampicillina, cloramfenicolo o trimetoprim. Per quanto ne sappiamo, questa osservazione non è mai stata confermata nelle infezioni umane.
Possibili limitazioni e svantaggi della terapia fagica
Nonostante tutti i vantaggi riassunti sopra, siamo lontani dal poter definire i fagi un “rimedio miracoloso” per trattare qualsiasi tipo di infezione. In effetti, la dose ottimale, la via di somministrazione, la frequenza e la durata del trattamento devono ancora essere stabilite prima di poter considerare studi clinici su larga scala.
Il principale svantaggio della terapia fagica è la necessità di determinare rapidamente e con precisione il microrganismo eziologico esatto che causa l’infezione. L’elevatissima specificità della terapia fagica contro determinati patogeni è un grande vantaggio, ma anche un limite. Un campione clinico deve essere isolato e coltivato usando procedure diagnostiche microbiologiche standard per identificare l’agente patogeno, prima che si possa definire una specifica soluzione di batteriofagi e successivamente somministrarla al paziente. Innovazioni nella diagnosi rapida dei batteri con metodi genomici o con l’uso della spettrometria di massa potrebbero aiutare. Tuttavia, nella maggior parte dei laboratori di microbiologia clinica e nelle strutture sanitarie con risorse limitate, questo è un processo che richiede tempo.
Questo problema potrebbe essere risolto potenzialmente usando cocktail di fagi pronti all’uso. La selezione di fagi potenti da una collezione disponibile dopo la tipizzazione fagica dei batteri isolati definisce il cosiddetto trattamento con cocktail di fagi “composto”. Infine, se non è disponibile alcun preparato fagico attivo contro un patogeno grave, può essere isolato direttamente dall’ambiente prima di essere preparato per l’uso.
Per esempio, durante la recente epidemia di E. coli O104:H4 in Germania, sono stati trovati fagi litici attivi nella collezione dell’Istituto Eliava (Georgia) e nelle acque reflue dell’Ospedale Militare di Bruxelles in Belgio.
La scelta del batteriofago per la terapia è limitata ai fagi litici.
Infatti, i fagi lisogeni inducono una lisi ritardata, impedendo l’uso di questi fagi in un’infezione acuta. Sebbene esistano metodi standardizzati per produrre cocktail di fagi, non ci sono linee guida ufficiali chiare.
La stabilità dei virus rispetto alla loro suscettibilità a diversi fattori esterni e fisici è stata recentemente rivista e potrebbe essere responsabile di alcune difficoltà nella produzione di soluzioni stabili.
Un’altra preoccupazione della terapia fagica è la potenziale capacità dei batteriofagi di trasferire DNA da un batterio a un altro. Questo trasferimento di materiale genetico, o trasduzione, potrebbe essere responsabile del trasferimento di determinanti di patogenicità e fattori di virulenza, portando allo sviluppo di un nuovo microrganismo o di batteri ancora più resistenti.
Pertanto, sarebbe preferibile usare fagi che non siano in grado di impacchettare DNA aggiuntivo dell’ospite, oppure fagi che utilizzino il DNA dell’ospite per sintetizzare il proprio DNA. Questa tecnica è già stata utilizzata con successo nella terapia fagica.
Il genoma di molti fagi è stato decodificato e ogni mese vengono riportate nuove sequenze geniche identificate. Tuttavia, siamo ancora lontani dal conoscere i geni di ogni tipo di fago e la funzione di molti di questi geni è ancora sconosciuta. Per esempio, i geni ORFan trovati in alcuni fagi non mostrano somiglianza con nessun altro gene nella banca dati genetica. Il ruolo di questi geni nel favorire effetti collaterali dannosi deve ancora essere chiarito.
Al termine della loro azione antibatterica, i fagi litici inducono la lisi dei batteri e rilasciano diverse sostanze batteriche, come l’endotossina (LPS) dei batteri gram-negativi. Questo può essere responsabile di vari effetti collaterali sull’ospite, come lo sviluppo di una cascata infiammatoria che porta a insufficienza multiorgano. Tuttavia, questo potenziale problema riguarda anche gli antibiotici battericidi rapidi attualmente disponibili.
Poiché sono virus, i batteriofagi possono essere considerati dal sistema immunitario del paziente come potenziali invasori e quindi essere rapidamente eliminati dalla circolazione sistemica tramite la clearance del sistema reticoloendoteliale, prima che possano accumularsi nella milza o nel fegato, oppure possono essere inattivati dai meccanismi di difesa immunitaria adattativa. Questo può portare a una ridotta efficacia in caso di uso prolungato o ripetuto.
Infine, lo sviluppo di meccanismi di resistenza da parte dell’ospite batterico, indotti da mutazione e selezione o dall’acquisizione di fagi temperati, potrebbe portare a una ridotta efficacia dei fagi. Esistono almeno 4 meccanismi coinvolti nella resistenza batterica a un determinato fago. La perdita o carenza del recettore, la modifica strutturale e/o la mascheratura del recettore impediscono l’adsorbimento dei fagi ai batteri e bloccano la successiva capacità di produrre nuovi fagi. La perdita del recettore può verificarsi quando cambia la composizione della superficie cellulare, come mostrato per Bordetella spp.
Per la proteina TraT di E. coli è stata rilevata una modifica strutturale che altera la conformazione di OmpA (Outer-Membrane Protein A), il recettore per i fagi simili ai T-even. La secrezione di diverse molecole (come l’esopolisaccaride di Pseudomonas spp. o i glicoconiugati di Enterobacteriacae) può mascherare il recettore, ma i fagi possono contrastare questo fenomeno selezionando un nuovo recettore o secernendo l’enzima che degrada l’esopolisaccaride.
Gli altri meccanismi di resistenza includono la prevenzione dell’integrazione del DNA fagico tramite il sistema di esclusione della superinfezione (Sie), la degradazione del DNA fagico tramite il sistema di difesa restrizione-modificazione o tramite Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), e il blocco della replicazione e trascrizione dei fagi, della traduzione o dell’assemblaggio dei virioni tramite il sistema di infezione abortiva.
Fortunatamente, la frequenza delle resistenze in vivo durante la terapia fagica è finora riportata come bassa, a differenza di quanto osservato nelle analisi di resistenza in vitro. Inoltre, l’isolamento di nuovi fagi attivi dall’ambiente o l’isolamento progressivo di fagi “adattati” potrebbe offrire una nuova opzione terapeutica.
Nella maggior parte dei Paesi, la terapia fagica non è coperta dall’assicurazione sanitaria obbligatoria, il che rappresenta per alcuni pazienti un potenziale problema economico. Esistono alcune eccezioni. Le autorità svizzere hanno deciso di rimborsare i costi della medicina complementare per un periodo di 6 anni, mentre viene valutata l’efficacia, e il presidente della città di Wroclaw (dove si trova l’Istituto Hirszfeld), in Polonia, ha creato un programma per coprire i costi della terapia fagica per i residenti della città; due esempi da seguire secondo Myedzybrodzki.
Poiché i virus batterici non sono attualmente riconosciuti come medicinali, le normative farmacologiche, le definizioni e gli standard attuali in Europa non sono adeguatamente adattati ai preparati a base di fagi. Per questo motivo, un gruppo di ricerca belga e alcuni membri dell’Institut Pasteur di Parigi hanno sviluppato PHAGE (Phages for Human Application Group Europe), un’organizzazione internazionale senza scopo di lucro con l’obiettivo di sviluppare un quadro specifico per l’uso dei batteriofagi.
L’approvazione regolatoria rimane un ulteriore ostacolo. Oltre alle preoccupazioni sulla sicurezza, né la Food and Drug Administration (FDA) statunitense né l’Agenzia Europea per i Medicinali dispongono di una procedura di autorizzazione in grado di tenere facilmente conto delle combinazioni di fagi in continua evoluzione che le aziende devono sviluppare per restare un passo avanti rispetto all’evoluzione dei batteri MDR.
Dati sperimentali sulla terapia fagica
Molti dati sperimentali sono stati prodotti a partire dai due studi pionieristici di Smith e Huggins, che all’inizio degli anni ’80 dimostrarono il potenziale ruolo dei batteriofagi nel contrastare infezioni sistemiche ed enteriti in topi, vitelli, suinetti e agnelli.
I topi sono stati ampiamente studiati come animali da esperimento, ma esistono anche report di terapie fagiche in modelli di laboratorio di infezioni in ratti, polli, conigli, vitelli e agnelli. Sono stati valutati diversi modelli di infezione, come l’iniezione intraperitoneale di batteri vivi che portava a un’infezione sistemica con batteriemia, l’iniezione intramuscolare di batteri, un’infezione del sistema nervoso centrale, un’infezione polmonare, ascessi epatici, enterite, infezione delle vie urinarie, infezione ossea, infezioni cutanee e delle ferite. I batteri utilizzati in questi modelli includevano E. coli, batteri MDR (Pseudomonas aeruginosa, E. coli e K. pneumoniae produttori di ESBL, Enterococcus faecium resistente alla vancomicina), Staphylococcus aureus e Chronobacter turicensis. Alcuni ceppi sono stati isolati direttamente dai pazienti. Le modalità di somministrazione della terapia fagica testate includono iniezione intraperitoneale, somministrazione orale o intragastrica, applicazione topica, iniezioni sottocutanee e intramuscolari e somministrazione intranasale. In alcuni studi la somministrazione dei fagi è stata considerata una misura profilattica; il trattamento è stato di solito somministrato come dose singola dopo la sfida batterica e, in alcuni studi, è stato somministrato in ritardo fino a quando gli animali non mostravano sintomi infettivi come diarrea o chiari segni di infezione grave.
Nel complesso, questi studi hanno mostrato effetti positivi sulla mortalità con la terapia fagica e, in 3 studi in cui la mortalità è stata valutata, i risultati erano significativamente migliori rispetto agli antibiotici usati come comparatori.
In uno studio su un modello di infezione ossea nei ratti, il trattamento combinato antibiotico-batteriofago ha ridotto in modo significativo la coltura quantitativa del sito infetto alla fine dello studio rispetto a entrambe le modalità di trattamento somministrate da sole.
Applicazioni umane già descritte
Nel primo report sull’uso dei batteriofagi nell’uomo, fu descritta l’efficacia nei foruncoli cutanei da stafilococco e d’Herelle nel 1931 riassunse tutti i suoi lavori clinici. Negli anni ’30 vi fu un gran numero di pubblicazioni e una monografia completa della rivista La Médicine fu dedicata alle applicazioni dei fagi nelle malattie umane. Furono descritti trattamenti per tifo, colite causata da Shigella e Salmonella spp., peritonite, infezioni cutanee, infezioni chirurgiche (principalmente ascessi di varie localizzazioni), setticemia, infezioni delle vie urinarie e infezioni otorinolaringoiatriche (otite esterna e solchi nasali).
Come già descritto, l’entusiasmo per la terapia fagica nei paesi occidentali diminuì negli anni ’30 a causa dei rapporti di Eaton e colleghi e anche come conseguenza della scoperta e del facile utilizzo degli antibiotici. L’uso dei batteriofagi continuò nei paesi orientali e nel corso del tempo furono pubblicati numerosi rapporti, soprattutto in Polonia e Georgia (ex URSS). L’uso di letteratura non inglese (principalmente russa e polacca) spiega probabilmente il fatto che questi rapporti rimasero limitati al paese d’origine degli autori. Una sintesi di questa letteratura è stata recentemente pubblicata da vari autori. Dobbiamo tuttavia notare che la maggior parte dei dati pubblicati proviene da studi non randomizzati e non controllati.
In effetti, il primo studio controllato randomizzato di fase I condotto negli Stati Uniti è stato pubblicato nel 2009. Ha valutato la sicurezza di un cocktail di fagi diretti contro E. coli, S. aureus e Pseudomonas aeruginosa in 42 pazienti con ulcere venose croniche alle gambe. Lo studio non ha potuto dimostrare risultati positivi come il tasso o la frequenza di guarigione, tuttavia gli autori non hanno riscontrato effetti collaterali correlati al trattamento. Un altro studio randomizzato è stato condotto nel Regno Unito e ha esaminato l’efficacia dell’applicazione di una soluzione contenente 6 batteriofagi nelle orecchie di pazienti con otite cronica causata da Pseudomonas aeruginosa. Il numero di colonie di P. aeruginosa nel gruppo trattato in questo studio ben condotto, in doppio cieco e controllato con placebo è diminuito significativamente, mentre vari indicatori clinici soggettivi sono migliorati in questi pazienti. Infatti, i pazienti hanno riportato una minore intensità dei sintomi come malessere, prurito, umidità e odore sgradevole. Allo stesso modo, i medici responsabili dei pazienti (e in cieco rispetto al trattamento assegnato) hanno riportato ridotte osservazioni cliniche come eritemi/infiammazioni, ulcerazioni/granulazioni/polipi e odori. Non sono stati segnalati effetti collaterali.
Recentemente è stato condotto un piccolo studio di fase I con 9 pazienti trattati presso il Burn Wound Center del Queen Astrid Military Hospital di Bruxelles, Belgio. I pazienti sono stati trattati localmente con il cocktail di fagi BFC-1, che conteneva 3 fagi litici: un Myovirus, un Podovirus contro Pseudomonas aeruginosa e un Myovirus diretto contro Staphylococcus aureus. Una grande sezione ustionata è stata esposta a una singola applicazione spray, mentre una parte distante della ferita è servita da controllo. Sebbene i risultati completi debbano ancora essere pubblicati, non è stato segnalato alcun problema di sicurezza.
Infine, uno studio controllato randomizzato ha confermato la sicurezza di una soluzione fagica somministrata per via orale in pazienti sani e non infetti.
Conclusioni
I batteriofagi sono un possibile strumento alternativo per il trattamento delle infezioni batteriche, comprese quelle causate da agenti patogeni MDR. Infatti, la terapia fagica presenta diversi vantaggi e vengono segnalati pochi eventi avversi, ma non si può escludere una sottostima. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi ben condotti per definire il ruolo e la sicurezza della terapia fagica nella pratica clinica quotidiana per il trattamento di pazienti con varie infezioni.
Inoltre, l’uso diretto di proteine codificate dai fagi come endolisine, esopolisaccaridasi e oline si è dimostrato un’alternativa promettente ai prodotti antibatterici. Tuttavia, questo argomento andrebbe oltre lo scopo di questa revisione.
Traduzione automatica della fonte: https://doi.org/10.4161/viru.25991
Xavier Wittebole, Sophie De Roock & Steven M Opal
