Een historisch overzicht van faagtherapie als alternatief voor antibiotica voor de behandeling van bacteriële pathogenen

“Met de lancering van het nieuwe Bacteriophage Journal begin 2011 definieerde Alexander Sulakvelidze bacteriofagen als ‘de meest alomtegenwoordige organismen op aarde, die een vitale rol spelen bij het handhaven van het microbiële evenwicht op deze planeet. Inderdaad, bacteriofagen, of fagen, worden overal gevonden waar hun bacteriële gastheer aanwezig is. Er is vastgesteld dat de faagpopulatie in watersystemen varieert van 10^4 tot 10^8 virionen per ml en ongeveer 10^9 virionen per g in de bodem.’” . FEMS Microbiol met een geschat totaal van 10^32 bacteriofagen op de planeet.

Bacteriofagen: een beoordeling van hun rol bij de behandeling van bacteriële infecties. Fagen, bijna een eeuw geleden beschreven door William Twort en kort daarna onafhankelijk ontdekt door Félix d’Herelle (door velen beschouwd als de grondlegger van bacteriofagen en hun therapeutische betekenis: faagtherapie), zijn kleine virussen die het vermogen hebben om bacteriën te doden zonder de cellijnen van andere organismen aan te tasten. Vanwege de specificiteit van cellulaire doelgastheren is de toepassing van fagen sinds hun introductie voorgesteld als therapie voor de behandeling van acute en chronische infecties, met de eerste successen beschreven in de disciplines dermatologie, oogheelkunde, urologie, stomatologie, kindergeneeskunde, KNO en chirurgie.

Het aanvankelijke enthousiasme voor faagtherapie om bacteriële ziekten te behandelen in het pre-antibiotische tijdperk was begrijpelijkerwijs enorm. De enige beschikbare therapie in de jaren 1920 en 1930 was immers serumtherapie voor geselecteerde pathogenen zoals pneumokokken en difterie. Het gebruik van bacteriofagen werd zelfs met grote belangstelling beschreven toen de hoofdpersoon van Sinclair Lewis’ met de Pulitzerprijs bekroonde roman, Arrowsmith, deze behandeling gebruikte om de uitbraak van de builenpest op een Caribisch eiland te bestrijden.

Dit concept van het therapeutisch gebruik van fagen voor de behandeling van bacteriële infecties was echter vanaf het begin zeer controversieel en werd niet algemeen geaccepteerd door het publiek en de medische gemeenschap. Vroege studies werden vaak bekritiseerd vanwege het ontbreken van passende controles en inconsistente resultaten. Het gebrek aan reproduceerbaarheid en de vele tegenstrijdige resultaten in diverse gepubliceerde studies leidden tot de conclusie dat het bewijs voor de therapeutische waarde van lytische filtraten grotendeels tegenstrijdig en niet overtuigend was, en er werd verder onderzoek aanbevolen om de vermeende voordelen te bevestigen. De opkomst van het tijdperk van de antibiotische chemotherapie met de introductie van sulfonamiden in de jaren 1930 en later penicilline in de jaren 1940 temperde het enthousiasme voor faagonderzoek en -therapie verder. Met name in het afgelopen decennium hebben onderzoekers, vanwege de opkomst van multiresistente bacteriën, deze eeuwenoude benadering opnieuw bekeken en faagtherapie overwogen als een “nieuwe” en potentieel levensvatbare behandelingsoptie voor moeilijk te behandelen bacteriële pathogenen.

In dit essay worden de oorsprong van faagtherapie, de biologie en levenscyclus van fagen, en een samenvatting van experimentele en klinische gegevens ter ondersteuning van faagtherapie bij de behandeling van multiresistente (MDR) bacteriële infecties en sepsis besproken. Het valt nog te bezien of faagtherapie ooit haar volledige therapeutische potentieel in de moderne intensive care zal bereiken, maar de praktische toepasbaarheid ervan als alternatief voor antibiotica voor de behandeling van menselijke sepsis veroorzaakt door pathogenen die meerdere antibioticaresistentiegenen dragen, wordt nu serieus overwogen.

Historische achtergrond

In 1896 toonde Ernest Hanbury Hankin, een Britse bacterioloog die werkzaam was als chemisch onderzoeker en bacterioloog voor de regering van de Verenigde Provinciën en Centrale Provinciën van India, aan dat het water van de Indiase rivieren de Ganges en de Yamuna een biologisch principe bevatte dat culturen van cholera-veroorzakende bacteriën vernietigde. Deze substantie kon door Millipore-filters passeren, waarvan bekend is dat ze grotere micro-organismen zoals bacteriën tegenhouden. Hij publiceerde zijn werk in het Frans in de Annales de l’Institut Pasteur. Tijdens het bestuderen van de groei van het vacciniavirus op celvrije agarmedia in 1915, observeerde de Britse microbioloog Frederick Twort dat “zuivere” bacteriële culturen geassocieerd konden worden met een permeabel filtreerbaar materiaal, dat er mogelijk toe kon leiden dat bacteriën uit een cultuur volledig uiteenvielen in korrels. Dit “filtreerbare agens” werd gedetecteerd in culturen van micrococci geïsoleerd uit vaccinia: materiaal van sommige kolonies die niet gesubkultureerd konden worden, was in staat om nieuwe groei van micrococci te infecteren, en deze toestand kon gedurende een kort, bijna onbepaald aantal generaties worden overgedragen op verse culturen van het micro-organisme. Dit transparante materiaal, waarvan werd vastgesteld dat het niet kon groeien zonder bacteriën, werd door Twort beschreven als een ferment dat door het micro-organisme werd uitgescheiden voor een doel dat op dat moment niet duidelijk was.

Twee jaar na dit verslag beschreef Félix d’Herelle onafhankelijk een vergelijkbare experimentele bevinding tijdens het bestuderen van patiënten die lieden aan of herstelden van bacillaire dysenterie. Hij isoleerde een zogenaamde “anti-Shiga-microbe” uit de ontlasting van shigellosepatiënten door ontlasting te filteren die 18 uur was geïncubeerd. Dit actieve filtraat kon, wanneer het werd toegevoegd aan een cultuur of een emulsie van Shiga-bacillen, leiden tot het stoppen van de cultuurgroei, de dood en uiteindelijk lysis van de bacillen. D’Herelle beschreef zijn ontdekking als een microbe die een “echte” microbe van immuniteit en een obligate bacteriofaag was. Hij demonstreerde ook de activiteit van deze anti-Shiga-microbe door proefdieren te inoculeren voor de behandeling van shigellose en leek de klinische betekenis van zijn bevinding te bevestigen door aan ten minste enkele van de postulaten van Koch te voldoen.

Afgezien van de feitelijke discussie over de herkomst van d’Herelle (sommigen beweren dat hij in Parijs is geboren, terwijl anderen Montreal claimen), werd de aanvankelijke controverse voornamelijk geleid door Bordet en zijn collega Gartia van het Institut Pasteur in Brussel. Deze auteurs maakten concurrerende claims over de exacte aard en betekenis van de fundamentele ontdekking. Terwijl Twort, wegens gebrek aan middelen en zijn verbondenheid met het Royal Army Medical Corps, zijn onderzoek op hetzelfde gebied niet voortzette, introduceerde d’Herelle het gebruik van bacteriofagen in de klinische geneeskunde en publiceerde hij vele niet-gerandomiseerde studies uit de hele wereld. Hij voerde ook behandelingen uit met intraveneuze fagen voor invasieve infecties, en hij vatte al deze bevindingen en waarnemingen samen in 1931. Het eerste gepubliceerde artikel over het klinische gebruik van fagen verscheen echter in België door Bruynoghe en Maisin, die bacteriofagen gebruikten om cutane furunkels en karbunkels te behandelen door Staphylococcus-specifieke fagen te injecteren nabij de basis van de steenpuisten. Zij beschreven duidelijk bewijs van klinische verbetering binnen 48 uur met een vermindering van pijn, zwelling en koorts bij de behandelde patiënten.

Op dat moment was de exacte aard van de faag nog niet bekend en bleef het een onderwerp van actief en levendig debat. Het gebrek aan kennis over de essentiële aard van DNA en RNA als de genetische essentie van het leven verhinderde een uitgebreider begrip van de faagbiologie in het begin van de 20e eeuw. In 1938 concludeerde John Northrop uit zijn eigen werk dat bacteriofagen werden geproduceerd door levende gastheren door de generatie van een inert eiwit, dat door een autokatalytische reactie wordt omgezet in de actieve faag.

Verschillende bijdragen van andere onderzoekers ondersteunden echter het idee van d’Herelle dat fagen levende deeltjes of virussen waren wanneer ze zich repliceerden binnen hun gastheercellen. In 1928 assimileerde Wollman de eigenschappen van fagen met die van genen. In 1925 bevestigden Bordet en Bail het idee dat het vermogen van fagen om zich in bacteriën voort te planten de invoeging van door fagen gecodeerd materiaal in de erfelijke eenheden van de gastmicrobe vereist. Frank Macfarlane, een Australische wetenschapper die in 1960 de Nobelprijs ontving voor zijn werk op het gebied van immuniteit, werkte ook aan lysogenie en bevestigde de virale aard van fagen en de aard van hun interacties met bacteriële gastheren. Hij toonde ook aan dat er verschillende soorten fagen bestaan.

Ten slotte stelde de uitvinding van de elektronenmicroscoop (EM) de Duitse arts Helmut Ruska in staat om voor het eerst bolvormige deeltjes en “spermavormige” deeltjes te beschrijven van een faagsuspensie die aan een bacterieel membraan kleefde. Twee jaar later vatte hij in zijn proefschrift zijn belangrijkste onderzoek naar de aard en biologie van bacteriofagen samen. Een jaar na de eerste beschrijving van fagen met EM presenteerden Luria en Anderson in Camden, New Jersey, verschillende soorten fagen en beschreven hun gemeenschappelijke structuur: een inhomogene bolvormige kop met een veel dunnere staart, wat het eigenaardige sperma-achtige uiterlijk geeft. Ze beschreven ook de verschillende stadia van bacteriële lysis: toenemende adsorptie in de loop van de tijd, uitgebreide bacteriële schade en het verschijnen van een groot aantal nieuw gevormde bacteriofagen.

 

Hoewel faagonderzoek nooit werd gestaakt in de voormalige USSR met de ontwikkeling van het Eliava Instituut in Tbilisi, Georgië, en enkele andere landen zoals Polen (en het bekende Hirszfeld Instituut in Wroclaw), herontdekte de Engelstalige literatuur faagtherapie bij dieren in de jaren 1980, en menselijke proeven begonnen in de jaren 2000, met de eerste gerandomiseerde Fase I-studie gepubliceerd in de VS in 2009.

In augustus 2004 vond de zogenaamde Phage Summit plaats in Key Biscayne, Florida. Meer dan 350 conferentiedeelnemers woonden deze eerste grote internationale bijeenkomst in decennia bij die gewijd was aan faagbiologie. Over het geheel genomen is faagliteratuur een van de meest uitgebreide onderwerpen geworden, waardoor bacteriofagen een van de meest grondig bestudeerde microben zijn die de wetenschap kent. In 1958 en 1967 publiceerde Raettig twee bibliografieën met ongeveer 11.358 referenties. In 2012 analyseerde Ackerman 30.000 faagpublicaties gepubliceerd tussen 1965 en 2010. De namen van de eerste auteurs vertegenwoordigen 40 taaldomeinen of geografische gebieden en ten minste 70 talen, wat leidde tot de conclusie dat faagdeeltjes wereldwijd worden bestudeerd (ook al overheersen de Engelse en Duitse taal).

 

Soorten fagen en faagbiologie

Meer dan 6.000 verschillende bacteriofagen zijn ontdekt en morfologisch beschreven, waaronder 6.196 bacteriële en 88 archaeale virussen. De overgrote meerderheid van deze virussen is getemperd, terwijl een klein deel polyhedraal, filamenteus of pleomorf is. Ze kunnen worden geclassificeerd op basis van hun morfologie, genetische inhoud (DNA vs. RNA), specifieke gastheer (bijvoorbeeld de Staphylococcus-faagfamilie, de Pseudomonas-faagfamilie, enz.), de locatie waar ze leven (marien virus vergeleken met andere habitats) en hun levenscyclus (zie hieronder). In de loop der tijd zijn nieuwe classificatieformaten voorgesteld, en afkortingen voor deze virussen werden in 2000 gesuggereerd door Fauquet en Pringle.

Als een obligate intracellulaire parasiet van een bacteriële cel vertonen fagen verschillende levenscycli binnen de bacteriële gastheer: lytisch, lysogeen, pseudolysogeen en chronische infectie.

In de faagtherapie is de belangrijkste belangstelling uitgegaan naar lytische fagen, voornamelijk vertegenwoordigd in drie families van de orde Caudovirales: de Myoviridae, de Siphoviridae en de Podoviridae. Er zijn ook enkele meldingen van toepassingen van kubische fagen en filamenteuze fagen. De algemene beschrijving van deze fagen kan als volgt worden samengevat: Het genetisch materiaal bevindt zich in een eiwitomhulsel of capside, dat de vorm heeft van een icosaëder; deze kop is via een kraag verbonden met de staart, die al dan niet contractiel kan zijn, en waarvan het distale uiteinde in contact staat met staartvezels waarvan de uiteinden aanhechtingsplaatsen op receptoren van het bacteriële celoppervlak herkennen.

Ongeacht het type faaglevenscyclus is de eerste stap de binding aan receptoren op de bacteriële celwand voordat fagen de bacteriën kunnen binnendringen. Dit specifieke proces beïnvloedt het spectrum van mogelijke interacties tussen fagen en bacteriën. Bacteriofaag λ interageert bijvoorbeeld alleen met de LamB-receptor van E. coli. Spatiotemporele dynamiek heeft aangetoond dat deze gebeurtenis van groot belang is voor een succesvolle bacteriële invasie. Sommige fagen zijn ook in staat om specifieke enzymen te synthetiseren (zoals hydrolases of polysaccharidases en polysaccharide lyases) die exopolysaccharide-structuurkapsels kunnen afbreken voordat ze kunnen interageren met hun specifieke

receptor. Dit is het geval voor sommige fagen die interageren met stammen van E. coli, V. cholerae, P. aeruginosa, E. agglomerans en P. putida. Deze enzymen zijn van potentieel belang voor hun therapeutische implicaties en bevinden zich momenteel in de preklinische ontwikkeling.

 

Bij binding aan de specifieke receptor induceren fagen een porie in de bacteriële celwand en injecteren ze hun DNA in de cel, terwijl de virale capside buiten de bacterie blijft. Dit wordt gevolgd door de expressie van vroege faaggenen, die, in het geval van lytische fagen, de bacteriële synthetische machinerie omleiden naar de reproductie van virale nucleïnezuren en eiwitten. De assemblage en verpakking van fagen worden vervolgens waargenomen voordat de lysis van bacteriële cellen en het vrijkomen van faagnageslacht plaatsvinden. De late enzymen van fagen, zoals lysines, holines en remmers van mureïnesynthese, worden vervolgens gebruikt voor het openbarsten van de virionen in de extracellulaire omgeving. Het aantal vrijgekomen virale deeltjes of de grootte van de bursts varieert sterk afhankelijk van de faag, de toestand van de bacteriële gastheer en andere omgevingsfactoren, zoals nutriëntencomponenten rond de gastheer.

In de lysogene cyclus voegen zogenaamde gematigde fagen hun genetische inhoud (de profaag) in de bacteriële chromosomen in, waar ze gedurende langere perioden sluimerend blijven en worden gerepliceerd als onderdeel van het bacteriële chromosoom. Er is dus geen zelfreplicatie. Dit profaag-DNA wordt verticaal overgedragen samen met het gehele bacteriële genoom naar het nageslacht totdat de lytische cyclus wordt geïnduceerd.

Tijdens inductie kan een lysogene faag incidenteel genetisch materiaal van de gastheer dat grenst aan de insertieplaats op het chromosoom overdragen van de ene bacterie naar de andere, een fenomeen dat bekend staat als transductie. In feite is de belangrijke rol van fagen in de evolutie van het bacteriële genoom al jaren bekend, en Brussow beschreef bacteriofagen zelfs als een middel voor laterale genoverdracht.

Dit proces kan de overdracht bevorderen van genen die een selectief voordeel bieden aan de bacteriële gastheer, waaronder antibioticaresistentiegenen; ditzelfde proces zou echter therapeutisch kunnen worden benut door fagen te gebruiken om genen over te dragen die bacteriën gevoeliger maken voor sommige antibiotica. Lu en Collins toonden in vitro inderdaad een verhoogde gevoeligheid van E. coli voor antibiotica aan door zich te richten op DNA-herstelmechanismen via de injectie van een specifiek gen dat leidde tot de overexpressie van een eiwit dat dit systeem remt. Geninsertie werd bereikt door een specifieke en gemodificeerde bacteriofaag M13. Interessant genoeg gebruikten ze dezelfde techniek ook bij muizen die intraperitoneaal waren geïnfecteerd met E. coli. De overleving was verhoogd bij muizen die gelijktijdig werden behandeld met antibiotica en gemodificeerde fagen. Deze benadering werd door andere auteurs vergelijkbaar geacht met de algemene benadering van faagtherapie, die leidt tot het direct doden van bacteriën.

 

Een andere benadering is het omkeren van resistentie tegen pathogenen door specifieke genen te injecteren voor een sensibilisatiecassette die dominant gevoeligheid verleent. Dit werd onlangs aangetoond door Edgar en collega’s, die in staat waren om resistente bacteriën gevoelig te maken voor streptomycine en nalidixinezuur.

Ten slotte treedt chronische infectie op wanneer de bacterie wordt geïnfecteerd door lysogene fagen die vervolgens muteren en het vermogen verliezen om een lytische replicatiecyclus te activeren. Het faag-DNA wordt een nieuw onderdeel van het bacteriële chromosoom en wordt een langdurige profaagsequentie.

 

Waarom hebben we faagtherapie nodig?

In de afgelopen twee of drie decennia is de wijdverbreide opkomst en verspreiding van antibioticaresistente bacteriën wereldwijd een grote therapeutische uitdaging geworden.

Zo werden MRSA-infecties in de VS gemeld met een incidentie van ongeveer 100.000 ernstige infecties in 2005, wat leidde tot 20.000 sterfgevallen.

De beperkte therapeutische opties voor de behandeling van de belangrijkste multiresistente bacteriën (MDR), bekend onder het acroniem ESKAPE-pathogenen (voor Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa en Enterobacter spp.), zijn nu een dreigende gezondheidscrisis geworden in veel intensive care-afdelingen wereldwijd.

De behandeling van patiënten met MDR-pathogenen is door Morales et al. aangetoond de totale zorgkosten te verhogen en de ziekenhuisopnames te verlengen.

In alle beroepen in de gezondheidszorg is er een ethische plicht om alles te doen wat in ons vermogen ligt om de effectiviteit van antibiotica te behouden en te erkennen dat deze kostbare hulpbron wordt verspild door het vaak onnodige en ongepaste gebruik van antibiotica, waardoor de verwerving en verspreiding van antibioticaresistentiegenen wordt bevorderd. Antibioticaresistentie wordt nu beschouwd als een noodsituatie in de gezondheidszorg, en velen roepen op tot de ontwikkeling van nieuwe middelen om dit te bestrijden. Antibiotica worden echter niet ontwikkeld op basis van direct publiek belang, maar op basis van vrije marktcriteria. Ondanks oproepen tot de ontwikkeling van nieuwe antibiotica in de Europese Unie (EU) en de Verenigde Staten (VS),

geeft de verklaring van de World Medical Association over antimicrobiële resistentie (www.wma.net/e/policy/a19htm) aan dat er een gebrek is aan nieuwe antibiotica in de ontwikkelingspijplijn.

Een volledig nieuwe, niet-antibiotische benadering voor de behandeling van bacteriële pathogenen is zeker nodig. De hernieuwde toepassing van faagtherapie zou een welkom alternatief kunnen zijn voor antimicrobiële chemotherapie in deze fase van progressieve verspreiding van bacteriële MDR-pathogenen met een gebrek aan nieuwe antibiotica om deze pathogenen te bestrijden.

Bovendien overstijgt de behoefte aan faagtoepassingen zeker hun gebruik bij menselijke infecties. Inderdaad is het gebruik van bacteriofagen beschreven in diverse situaties, waaronder (maar niet beperkt tot): voedselveiligheid,

veterinaire toepassingen en klinische diagnostische toepassingen zoals detectie en typering van bacteriën bij menselijke infecties.

 

Potentiële voordelen van faagtherapie

Bacteriofagen zijn natuurlijke antibiotica die in staat zijn om bacteriële populaties te reguleren door bacteriële lysis te induceren. Ze zijn actief tegen zowel grampositieve als gramnegatieve bacteriën.

Aangezien het werkingsmechanisme van faaglysis volledig verschilt van dat van antibiotica, blijft de activiteit tegen bacteriën die meerdere mechanismen van antibioticaresistentie vertonen, behouden.

Vanwege hun specificiteit heeft faagtherapie een smal antibacterieel spectrum met een effect dat beperkt is tot een enkele soort of, in sommige gevallen, een enkele stam binnen een soort. Dit beperkt de “druk” en ernstige nevenschade die optreedt bij omringende, niet-doelbacteriën door antibiotica. Het gehele microbioom van de patiënt wordt veranderd door antibiotica, niet alleen de beoogde doelpathogeen. Chibani-Chennoufi et al. toonden slechts geringe effecten op de darmmicrobiota bij muizen na orale toediening van op E. coli gerichte faagtherapie. Het behoud van een groot deel van het bestaande microbioom tijdens faagtherapie is bevestigd in zorgvuldige microbiële onderzoeken bij volwassen gezonde vrijwilligers die een cocktail van 9 fagen ontvingen.

Faagtherapie voorkomt ook de potentiële overgroei van secundaire pathogenen.

Omdat er momenteel geen grote, gerandomiseerde, gecontroleerde onderzoeken zijn, is het moeilijk om bijwerkingen en hun potentiële impact te beoordelen. Op basis van rapporten uit Polen en de voormalige Sovjet-Unie lijkt faagtherapie zonder significante nadelige effecten te zijn. Het feit dat bacteriofagen alleen interageren met bacteriële cellen en niet interfereren met zoogdiercellen zou mogelijk het gebrek aan schadelijke bijwerkingen kunnen verklaren. Onderrapportage zou een andere verklaring kunnen zijn. De uitstekende verdraagbaarheid van faagbehandeling is echter aangetoond in preklinische studies in verschillende diermodellen en in diverse observationele studies bij patiënten en gezonde proefpersonen. Systemische toediening leidt tot een brede verspreiding van fagen, inclusief het vermogen om de bloed-hersenbarrière te passeren, waardoor deze middelen kunnen worden gebruikt bij infecties van het centrale zenuwstelsel.

Interessant genoeg vertonen ten minste sommige fagen ook het vermogen om bacteriële biofilms te vernietigen.

Faagtherapie kan de ontstekingsreactie op een infectie beïnvloeden. Bij 51 patiënten met diverse langdurige etterende infecties was de TNFα-afgifte in vivo en in vitro verminderd na stimulatie met LPS, gebaseerd op het initiële patroon van TNFα-serumspiegels. De IL-6-afgifte was alleen in vivo significant verminderd. C-reactief proteïne en het aantal leukocyten waren aanvankelijk niet aangetast in deze patiëntenpopulatie, terwijl ze significant afnamen tussen dag 9 en dag 32 bij 37 patiënten die orale faagtherapie kregen voor osteomyelitis, infectie van gewrichtsprothesen, huid- en weke delen infecties en in één geval een longinfectie.

Dit was een observationele studie zonder controlegroep en moet daarom met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. In een recentere waarneming werd CRP alleen beïnvloed bij patiënten wiens initiële CRP-serumspiegel boven de 10 mg/dL lag.

Witte bloedcellen kunnen ook worden beïnvloed door faagtherapie: bij patiënten na 3 weken en 3 maanden therapie werden verhoogde neutrofiele precursoren en een verlaagde fagocytose-index voor Staphylococcus aureus waargenomen in vergelijking met gezonde donoren. Onlangs werd een uitgebreid overzicht gepubliceerd over de verandering van immuunresponsen tijdens faagtherapie.

Ten slotte zijn de economische aspecten van faagtherapie veelbelovend. Ondanks het feit dat de duur van de behandeling aanzienlijk langer was, waren de kosten van faagtherapie lager dan bij conventionele antibioticabehandeling, zoals aangetoond bij 6 patiënten met diverse stafylokokkeninfecties, waaronder methicilline-resistente Staphylococcus aureus.

Bovenal is het feit dat bacteriofagen een verbeterde werkzaamheid zouden kunnen hebben in vergelijking met antibiotica de grootste hoop voor de toekomst. Smith en collega’s toonden deze bevinding voor het eerst aan in de vroege jaren 1980 toen ze een dodelijke E. coli-infectie induceerden bij muizen met een zeer virulente stam die een K1-polysaccharidekapsel tot expressie bracht.

Een enkele intramusculaire dosis anti-K1-fagen was even effectief als meerdere streptomycine-injecties en superieur aan meerdere intramusculaire doses tetracycline, ampicilline, chlooramfenicol of trimethoprim bij het genezen van de dieren. Voor zover wij weten, is deze waarneming nooit bevestigd bij menselijke infecties.

 

Potentiële beperkingen en nadelen van faagtherapie

Ondanks alle hierboven samengevatte voordelen, zijn we er nog lang niet om fagen een “wonderkuur” te noemen voor de behandeling van elk type infectie. De optimale dosis, toedieningsweg, frequentie en duur van de behandeling moeten immers nog worden bepaald voordat grootschalige klinische proeven worden overwogen.

Het belangrijkste nadeel van faagtherapie is de noodzaak om snel en nauwkeurig het exacte etiologische micro-organisme te bepalen dat de infectie veroorzaakt. De voortreffelijke specificiteit van faagtherapie tegen specifieke pathogenen is een groot voordeel, maar ook een last. Een klinisch monster moet worden geïsoleerd en gekweekt met behulp van standaard microbiologische diagnostische procedures om de pathogeen te identificeren voordat een specifieke bacteriofaagoplossing kan worden gedefinieerd en later aan de patiënt kan worden toegediend. Innovaties in snelle bacteriële diagnose met behulp van genomische methoden of massaspectrometrie zouden een oplossing kunnen bieden. In de meeste klinische microbiologische laboratoria en zorginstellingen met beperkte middelen is dit echter een tijdrovend proces.

Dit probleem zou mogelijk kunnen worden opgelost door gebruik te maken van kant-en-klare faagcocktails. De selectie van krachtige fagen uit een beschikbare collectie na faagtypering van de geïsoleerde bacteriën definieert de zogenaamde samengestelde faagcocktailbehandeling. Ten slotte, als er geen actieve, bestaande faagpreparatie beschikbaar is tegen een ernstige pathogeen, kan deze rechtstreeks uit de omgeving worden geïsoleerd voordat deze wordt voorbereid voor toepassing.

Tijdens de recente uitbraak van E. coli O104:H4 in Duitsland werden bijvoorbeeld actieve lytische fagen gevonden in de collectie van het Eliava Instituut (Georgië) en in het afvalwater van het Militair Hospitaal in Brussel, België.

De keuze van bacteriofagen voor therapie is beperkt tot lytische fagen.

Lysogene fagen induceren immers vertraagde lysis, wat het gebruik van deze fagen bij een acute infectie verhindert. Hoewel er gestandaardiseerde methoden bestaan voor het genereren van faagcocktails, zijn er geen duidelijke officiële richtlijnen.

De stabiliteit van virussen met betrekking tot hun gevoeligheid voor diverse externe en fysieke factoren is onlangs herzien en zou verantwoordelijk kunnen zijn voor enkele moeilijkheden bij het produceren van stabiele oplossingen.

Een ander punt van zorg bij faagtherapie is het potentiële vermogen van bacteriofagen om DNA van de ene bacterie naar de andere over te dragen. Deze overdracht van genetisch materiaal, of transductie, zou verantwoordelijk kunnen zijn voor de overdracht van pathogeniteitsdeterminanten en virulentiefactoren, wat zou kunnen leiden tot de ontwikkeling van een nieuwe microbe of zelfs nog resistentere bacteriën.

Daarom zou de voorkeur uitgaan naar het gebruik van fagen die niet in staat zijn om extra gastheer-DNA te verpakken, of fagen die gastheer-DNA gebruiken om hun eigen DNA te synthetiseren. Deze techniek is al met succes toegepast in faagtherapie.

Het genoom van veel fagen is ontcijferd, en elke maand zijn er meldingen van nieuw geïdentificeerde gensequenties. We zijn echter nog ver verwijderd van het kennen van het gen van elk type faag, en de functie van veel van deze genen is nog onbekend. De ORFan-genen die in sommige fagen worden gevonden, vertonen bijvoorbeeld geen gelijkenis met enig ander gen in de gendatabase. De rol van deze genen bij het bevorderen van schadelijke bijwerkingen moet nog worden opgehelderd.

Aan het einde van hun antibacteriële werking induceren lytische fagen de lysis van bacteriën en komen diverse bacteriële stoffen vrij, zoals endotoxine (LPS) van gramnegatieve bacteriën. Dit kan verantwoordelijk zijn voor diverse bijwerkingen bij de gastheer, zoals de ontwikkeling van een ontstekingscascade die leidt tot meervoudig orgaanfalen. Dit potentiële probleem treft echter ook de momenteel beschikbare snel bactericide antibiotica.

Omdat het virussen zijn, kunnen bacteriofagen door het immuunsysteem van de patiënt worden beschouwd als potentiële indringers en daarom snel uit de systemische circulatie worden geëlimineerd door het reticulo-endotheliale systeem voordat ze zich kunnen ophopen in de milt of lever, of ze kunnen worden geïnactiveerd door adaptieve immuunafweermechanismen. Dit kan leiden tot verminderde werkzaamheid bij langdurig of herhaald gebruik.

Ten slotte zou de ontwikkeling van resistentiemechanismen door de bacteriële gastheer, geïnduceerd door mutatie en selectie of door de verwerving van gematigde fagen, kunnen leiden tot verminderde werkzaamheid van fagen. Er zijn ten minste 4 mechanismen die betrokken kunnen zijn bij bacteriële resistentie tegen een specifieke faag. Verlies of gebrek aan receptor, structurele modificatie en/of maskering van de receptor voorkomen faagadsorptie aan de bacteriën en verhinderen het verdere vermogen om nieuwe fagen te produceren. Receptorverlies kan optreden wanneer de samenstelling van het celoppervlak verandert, zoals is aangetoond voor Bordetella spp.

Een structurele modificatie werd gevonden voor het E. coli-eiwit TraT, dat de conformatie van OmpA (Outer-Membrane Protein A) wijzigt, de receptor voor T-Even-achtige fagen. Secretie van diverse moleculen (zoals exopolysaccharide van Pseudomonas spp. of glycoconjugaten van Enterobacteriaceae) kan de receptor maskeren, maar fagen kunnen dit tegengaan door een nieuwe receptor te selecteren of door het exopolysaccharide-afbrekende enzym uit te scheiden.

De andere resistentiemechanismen omvatten het voorkomen van faag-DNA-integratie door het Superinfection Exclusion System (Sie), afbraak van faag-DNA door het Restriction-Modification-afweersysteem of door Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), en het blokkeren van faagreplicatie en transcriptie, translatie of virion-assemblage door het Abortive Infection-systeem.

Gelukkig is de frequentie van resistentie in vivo tijdens faagtherapie tot nu toe laag gerapporteerd, in tegenstelling tot de waargenomen in vitro resistentie-analyses. Bovendien zou de isolatie van nieuwe actieve fagen uit de omgeving of de progressieve isolatie van “aangepaste” fagen een nieuwe behandeloptie kunnen bieden.

In de meeste landen wordt faagtherapie niet gedekt door de wettelijke ziektekostenverzekering, wat een potentieel financieel probleem vormt voor sommige patiënten. Er zijn enkele uitzonderingen. De Zwitserse autoriteiten hebben besloten de kosten van complementaire geneeskunde te vergoeden voor een periode van 6 jaar terwijl de werkzaamheid wordt geëvalueerd, en de burgemeester van de stad Wroclaw (waar het Hirszfeld Instituut is gevestigd), Polen, heeft een programma opgezet om de kosten van faagtherapie voor de inwoners van de stad te dekken; 2 voorbeelden om te volgen volgens Myedzybrodzki.

Aangezien bacteriële virussen momenteel niet worden erkend als geneesmiddelen, zijn de huidige farmacologische regelgeving, definities en normen in Europa niet adequaat aangepast aan faagpreparaten. Om deze reden heeft een Belgische onderzoeksgroep en enkele leden van het Institut Pasteur in Parijs PHAGE (voor Phages for Human Application Group Europe) opgericht, een internationale non-profitorganisatie met als doel een specifiek kader te ontwikkelen voor het gebruik van bacteriofagen.

Regelgevende goedkeuring blijft een ander obstakel. Naast veiligheidsoverwegingen hebben noch de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA), noch het Europees Geneesmiddelenbureau een goedkeuringsproces dat gemakkelijk kan worden aangepast aan de voortdurend veranderende faagcombinaties die bedrijven moeten ontwikkelen om de ontwikkeling van MDR-bacteriën voor te blijven.

Experimentele gegevens met faagtherapie

Er zijn veel experimentele gegevens gegenereerd sinds de twee baanbrekende studies van Smith en Huggins, die in de vroege jaren 1980 de potentiële rol van bacteriofagen bij het bestrijden van systemische infecties en enteritis bij muizen, kalveren, biggen en lammeren aantoonden.

Muizen zijn uitgebreid bestudeerd als proefdieren, maar er zijn ook meldingen van faagtherapieën in laboratoriummodellen van infecties bij ratten, kippen, konijnen, kalveren en lammeren. Diverse infectiemodellen zijn geëvalueerd, zoals intraperitoneale injectie van levende bacteriën leidend tot systemische infectie met bacteriëmie, intramusculaire injectie van bacteriën, infectie van het centrale zenuwstelsel, longinfectie, leverabcessen, enteritis, urineweginfectie, botinfectie, huid- en wondinfecties. Bacteriën die in deze modellen werden gebruikt, omvatten E. coli, MDR-bacteriën (Pseudomonas aeruginosa, ESBL-producerende E. coli en K. pneumoniae, vancomycine-resistente Enterococcus faecium), Staphylococcus aureus en Chronobacter turicensis. Sommige stammen werden rechtstreeks van patiënten geïsoleerd. De geteste toedieningsprocedures voor faagtherapie omvatten intraperitoneale injectie, orale of intragastrische toediening, topische, subcutane en intramusculaire injecties, en intranasale toediening. Hoewel in sommige studies faagtoediening als een profylactische maatregel werd beschouwd, werd de behandeling gewoonlijk toegediend als een enkele dosis na bacteriële uitdaging en in sommige studies werd deze uitgesteld totdat de dieren symptomen van diarree-infectie of duidelijke tekenen van ernstige infectie vertoonden.

Over het geheel genomen toonden deze studies positieve effecten op de mortaliteit onder faagtherapie, en in 3 studies waarin de mortaliteit werd beoordeeld, waren de resultaten aanzienlijk beter dan met antibiotica die als vergelijkingsmiddelen werden gebruikt.

In één studie van het geïnfecteerde botmodel bij ratten verminderde een gecombineerde antibiotica-bacteriofaagbehandeling de kwantitatieve cultuur van de geïnfecteerde plaats aan het einde van de studie aanzienlijk in vergelijking met beide behandelingsmodaliteiten die alleen werden gegeven.

Reeds beschreven menselijke toepassingen

In het eerste verslag over het gebruik van bacteriofagen bij mensen werd de werkzaamheid aangetoond bij stafylokokken-huidfurunkels, en d’Herelle vatte al zijn klinische werk samen in 1931. In de jaren 1930 was er een groot aantal publicaties en een volledige monografie van het tijdschrift La Médicine behandelde faagtoepassingen bij menselijke ziekten. De behandeling van tyfus, Shigella- en Salmonella spp.-gerelateerde colitis, peritonitis, huidinfecties, chirurgische infecties (voornamelijk abcessen op diverse locaties), septicemie, urineweginfecties en otolaryngologische infecties (otitis externa en neusfurunkels) werd beschreven.

Zoals eerder beschreven, nam het enthousiasme voor faagtherapie in westerse landen in de jaren 1930 af als gevolg van de rapporten van Eaton en collega’s en ook als gevolg van de ontdekking en het gebruiksgemak van antibiotica. Het gebruik van bacteriofagen werd voortgezet in oosterse landen, en in de loop der tijd werden talrijke rapporten gepubliceerd, voornamelijk in Polen en Georgië (voormalige USSR). Het gebruik van niet-Engelstalige literatuur (voornamelijk Russisch en Pools) verklaart waarschijnlijk het feit dat deze rapporten beperkt bleven tot de landen van herkomst van de auteurs. Een samenvatting van deze literatuur werd onlangs door diverse auteurs gepubliceerd. We moeten echter opmerken dat de meeste gepubliceerde gegevens afkomstig zijn van niet-gerandomiseerde, ongecontroleerde studies.

In feite werd de eerste gecontroleerde gerandomiseerde Fase I-studie uitgevoerd in de Verenigde Staten gepubliceerd in 2009. Het evalueerde de veiligheid van een cocktail van fagen gericht tegen E. coli, S. aureus en Pseudomonas aeruginosa bij 42 patiënten met chronische veneuze beenzweren. De studie kon geen positieve resultaten aantonen zoals genezingssnelheid of frequentie; de auteurs merkten echter geen bijwerkingen op die verband hielden met de behandeling. Een andere gerandomiseerde studie werd uitgevoerd in het Verenigd Koninkrijk en onderzocht de effectiviteit van het aanbrengen van een oplossing met 6 bacteriofagen in de oren van patiënten met chronische Pseudomonas aeruginosa-gerelateerde otitis. Het aantal P. aeruginosa-kolonies in de behandelde groep in deze goed uitgevoerde, dubbelblinde, placebo-gecontroleerde studie nam aanzienlijk af, terwijl diverse subjectieve klinische indicatoren bij deze patiënten verbeterden. Patiënten rapporteerden inderdaad een verminderde intensiteit van symptomen zoals ongemak, jeuk, nattigheid en onaangename geur. Evenzo rapporteerden de artsen die verantwoordelijk waren voor de patiënten (en geblindeerd waren voor de toegewezen behandeling) verminderde klinische waarnemingen zoals erytheem/ontsteking, ulceratie/granulatie/poliepen en geuren. Er werden geen bijwerkingen gemeld.

Onlangs werd een kleine Fase I-studie uitgevoerd met 9 patiënten die werden behandeld in het Brandwondencentrum van het Militair Hospitaal Koningin Astrid in Brussel, België. De patiënten werden lokaal behandeld met de BFC-1 faagcocktail, die 3 lytic fagen bevatte: een myovirus, een podovirus gericht tegen Pseudomonas aeruginosa en een myovirus gericht tegen Staphylococcus aureus. Een groot verbrand gedeelte werd blootgesteld aan een enkele spray-applicatie, terwijl een verafgelegen deel van de wond als controle diende. Hoewel de volledige resultaten nog moeten worden gepubliceerd, werden er geen veiligheidsproblemen gemeld.

Ten slotte bevestigde een gerandomiseerde gecontroleerde studie de veiligheid van een oraal toegediende faagoplossing bij gezonde, niet-geïnfecteerde patiënten.

Conclusies

Bacteriofagen zijn een potentieel alternatief hulpmiddel voor de behandeling van bacteriële infecties, inclusief infecties veroorzaakt door MDR-pathogenen. In feite biedt faagtherapie verschillende voordelen en worden er slechts weinig bijwerkingen gerapporteerd, hoewel onderrapportage niet kan worden uitgesloten. Er zijn echter meer goed uitgevoerde studies nodig om de rol en veiligheid van faagtherapie in de dagelijkse klinische praktijk te definiëren voor de behandeling van patiënten met diverse infecties.

Bovendien is het directe gebruik van door fagen gecodeerde eiwitten, zoals endolysines, exopolysaccharidases en holines, een veelbelovend alternatief gebleken voor antibacteriële producten. Dit onderwerp zou echter de reikwijdte van dit overzicht overschrijden.

 

Machinevertaling van de bron: https://doi.org/10.4161/viru.25991

Xavier Wittebole, Sophie De Roock & Steven M Opal