Una panoramica storica della terapia fagica come alternativa agli antibiotici per il trattamento di patogeni batterici

“Con il lancio della nuova rivista Bacteriophage all’inizio del 2011, Alexander Sulakvelidze ha definito i batteriofagi come “gli organismi più ubiquitari sulla Terra, che svolgono un ruolo vitale nel mantenimento dell’equilibrio microbico su questo pianeta. Infatti, i batteriofagi, o fagi, si trovano ovunque sia presente il loro ospite batterico. È stato determinato che la popolazione di fagi nei sistemi idrici varia da 10^4 a 10^8 virioni per ml e circa 10^9 virioni per g nel suolo.” FEMS Microbiol con una stima totale di 10^32 batteriofagi sul pianeta.

Batteriofagi: una valutazione del loro ruolo nel trattamento delle infezioni batteriche. I fagi, descritti quasi un secolo fa da William Twort e scoperti indipendentemente poco dopo da Félix d’Herelle (considerato da molti il fondatore dei batteriofagi e del loro significato terapeutico: la terapia fagica), sono piccoli virus che hanno la capacità di uccidere i batteri senza influenzare le linee cellulari di altri organismi. A causa della specificità degli ospiti cellulari bersaglio, l’applicazione dei fagi è stata proposta come terapia per il trattamento di infezioni acute e croniche fin dalla loro introduzione, con i primi successi descritti nelle discipline di dermatologia, oftalmologia, urologia, stomatologia, pediatria, otorinolaringoiatria e chirurgia.

L’entusiasmo iniziale per la terapia fagica nel trattamento delle malattie batteriche nell’era pre-antibiotica era comprensibilmente enorme. Infatti, l’unica terapia disponibile negli anni ’20 e ’30 era la sieroterapia per patogeni selezionati come pneumococchi e difterite. L’uso dei batteriofagi fu persino descritto con grande interesse quando il protagonista del romanzo vincitore del Premio Pulitzer di Sinclair Lewis, Arrowsmith, utilizzò questo trattamento per combattere l’epidemia di peste bubbonica su un’isola caraibica.

Tuttavia, questo concetto dell’uso terapeutico dei fagi per il trattamento delle infezioni batteriche fu fin dall’inizio molto controverso e non ampiamente accettato dal pubblico e dalla comunità medica. I primi studi furono spesso criticati per la mancanza di controlli appropriati e risultati incoerenti. La mancanza di riproducibilità e i numerosi risultati contrastanti ottenuti in vari studi pubblicati portarono alla conclusione che le prove del valore terapeutico dei filtrati litici erano in gran parte contraddittorie e inconcludenti, e furono raccomandate ulteriori ricerche per confermarne i presunti benefici. L’emergere dell’era della chemioterapia antibiotica con l’introduzione dei sulfamidici negli anni ’30 e successivamente della penicillina negli anni ’40 smorzò ulteriormente l’entusiasmo per la ricerca e la terapia fagica. In particolare, nell’ultimo decennio, a causa dell’emergere di batteri multiresistenti, i ricercatori hanno riesaminato questo approccio centenario, considerando la terapia fagica come un’opzione di trattamento “nuova” e potenzialmente valida per patogeni batterici difficili da trattare.

Questo saggio discuterà le origini della terapia fagica, la biologia e il ciclo vitale dei fagi, e un riepilogo dei dati sperimentali e clinici a sostegno della terapia fagica nel trattamento delle infezioni batteriche multiresistenti (MDR) e della sepsi. Resta da vedere se la terapia fagica raggiungerà mai il suo pieno potenziale terapeutico nella moderna terapia intensiva, ma la sua applicabilità pratica come alternativa agli antibiotici per il trattamento della sepsi umana causata da patogeni portatori di molteplici geni di resistenza agli antibiotici è ora seriamente presa in considerazione.

Contesto storico

Nel 1896, Ernest Hanbury Hankin, un batteriologo britannico che prestava servizio come esaminatore chimico e batteriologo per il governo delle Province Unite e delle Province Centrali dell’India, dimostrò che le acque dei fiumi indiani Ganga e Yamuna contenevano un principio biologico che distruggeva le colture di batteri che causano il colera. Questa sostanza poteva passare attraverso i filtri Millipore, noti per trattenere microrganismi più grandi come i batteri. Pubblicò il suo lavoro in francese negli Annales de l’Institut Pasteur. Mentre studiava la crescita del virus della vaccinia su terreni di agar privi di cellule nel 1915, il microbiologo britannico Frederick Twort osservò che le colture batteriche “pure” potevano essere associate a un materiale filtrabile permeabile, che poteva potenzialmente causare la completa disintegrazione dei batteri di una coltura in granuli. Questo “agente filtrabile” fu rilevato in colture di micrococchi isolati dalla vaccinia: il materiale di alcune colonie che non potevano essere subcoltivate era in grado di infettare nuove crescite di micrococchi, e questa condizione poteva essere trasferita a colture fresche del microrganismo per un numero breve, quasi indefinito di generazioni. Questo materiale trasparente, che si scoprì incapace di crescere senza batteri, fu descritto da Twort come un fermento escreto dal microrganismo per uno scopo non chiaro all’epoca.

Due anni dopo questo rapporto, Félix d’Herelle descrisse indipendentemente un risultato sperimentale simile mentre studiava pazienti affetti da dissenteria bacillare o in fase di guarigione. Isolò un cosiddetto “microbo anti-Shiga” dalle feci di pazienti con shigellosi filtrando feci incubate per 18 ore. Questo filtrato attivo, quando aggiunto a una coltura o a un’emulsione di bacilli Shiga, poteva causare l’arresto della crescita della coltura, la morte e infine la lisi dei bacilli. D’Herelle descrisse la sua scoperta come un microbo che era un “vero” microbo dell’immunità e un batteriofago obbligato. Dimostrò anche l’attività di questo microbo anti-Shiga inoculando animali da laboratorio per il trattamento della shigellosi e sembrò confermare il significato clinico della sua scoperta soddisfacendo almeno alcuni dei postulati di Koch.

A parte l’effettiva discussione sull’origine di d’Herelle (alcuni affermano che sia nato a Parigi, mentre altri sostengono Montreal), la controversia iniziale fu principalmente guidata da Bordet e dal suo collega Gartia all’Istituto Pasteur di Bruxelles. Questi autori avanzarono rivendicazioni concorrenti sulla natura esatta e sul significato della scoperta fondamentale. Mentre Twort, a causa della mancanza di fondi e della sua affiliazione con il Royal Army Medical Corps, non continuò la sua ricerca nello stesso campo, d’Herelle introdusse l’uso dei batteriofagi nella medicina clinica e pubblicò molti studi non randomizzati da tutto il mondo. Condusse anche trattamenti con fagi per via endovenosa per infezioni invasive, e riassunse tutti questi risultati e osservazioni nel 1931. Tuttavia, il primo articolo pubblicato sull’uso clinico dei fagi fu in Belgio da Bruynoghe e Maisin, che utilizzarono batteriofagi per trattare foruncoli e carbonchi cutanei iniettando fagi specifici per Staphylococcus vicino alla base dei foruncoli cutanei. Descrissero chiare evidenze di miglioramento clinico entro 48 ore con una riduzione del dolore, del gonfiore e della febbre nei pazienti trattati.

A quel tempo, la natura esatta del fago non era ancora nota e rimase oggetto di dibattito attivo e vivace. La mancanza di conoscenza sulla natura essenziale del DNA e dell’RNA come essenza genetica della vita impedì una comprensione più completa della biologia dei fagi all’inizio del XX secolo. Nel 1938, John Northrop concluse dal suo lavoro che i batteriofagi erano prodotti da ospiti viventi attraverso la generazione di una proteina inerte, che viene convertita nel fago attivo da una reazione autocatalitica.

Tuttavia, diversi contributi di altri ricercatori supportarono l’idea di d’Herelle che i fagi fossero particelle viventi o virus quando si replicavano all’interno delle loro cellule ospiti. Nel 1928, Wollman assimilò le proprietà dei fagi a quelle dei geni. Nel 1925, Bordet e Bail confermarono l’idea che la capacità dei fagi di riprodursi nei batteri richiedesse l’inserimento di materiale codificato dal fago nelle unità ereditarie del microbo ospite. Frank Macfarlane, uno scienziato australiano che ricevette il Premio Nobel nel 1960 per il suo lavoro sull’immunità, lavorò anche sulla lisogenia e confermò la natura virale dei fagi così come la natura delle loro interazioni con gli ospiti batterici. Dimostrò anche che esistono diversi tipi di fagi.

Infine, l’invenzione del microscopio elettronico (EM) permise al medico tedesco Helmut Ruska di descrivere per primo particelle sferiche così come particelle “a forma di spermatozoo” da una sospensione di fagi aderenti a una membrana batterica. Due anni dopo, nella sua dissertazione, riassunse la sua ricerca più importante sulla natura e la biologia dei batteriofagi. Un anno dopo la prima descrizione dei fagi con EM, Luria e Anderson a Camden, New Jersey, presentarono vari tipi di fagi e descrissero la loro struttura comune: una testa sferica non omogenea con una coda molto più sottile, che conferisce il peculiare aspetto simile a uno spermatozoo. Descrissero anche le diverse fasi della lisi batterica: aumento dell’adsorbimento nel tempo, esteso danno batterico e comparsa di un gran numero di batteriofagi di nuova formazione.

 

Mentre la ricerca sui fagi non fu mai abbandonata nell’ex URSS con lo sviluppo dell’Istituto Eliava a Tbilisi, Georgia, e in alcuni altri paesi come la Polonia (e il noto Istituto Hirszfeld a Wroclaw), la letteratura inglese riscoprì la terapia fagica negli animali negli anni ’80, e gli studi sull’uomo iniziarono negli anni 2000, con il primo studio randomizzato di Fase I pubblicato negli USA nel 2009.

Nell’agosto 2004, si tenne il cosiddetto Phage Summit a Key Biscayne, Florida. Oltre 350 partecipanti al convegno parteciparono a questo primo grande incontro internazionale in decenni dedicato alla biologia dei fagi. Nel complesso, la letteratura sui fagi è diventata uno degli argomenti più estesi, rendendo i batteriofagi uno dei microbi più studiati a fondo conosciuti dalla scienza. Nel 1958 e nel 1967, Raettig pubblicò due bibliografie con circa 11.358 riferimenti. Nel 2012, Ackerman analizzò 30.000 pubblicazioni sui fagi pubblicate tra il 1965 e il 2010. I nomi dei primi autori rappresentano 40 domini linguistici o aree geografiche e almeno 70 lingue, portando alla conclusione che le particelle di fagi sono studiate in tutto il mondo (anche se predominano le lingue inglese e tedesca).

 

Tipi di fagi e biologia dei fagi

Sono stati scoperti e descritti morfologicamente più di 6.000 batteriofagi diversi, inclusi 6.196 virus batterici e 88 virus archeali. La stragrande maggioranza di questi virus è attenuata, mentre una piccola parte è poliedrica, filamentosa o pleomorfa. Possono essere classificati in base alla loro morfologia, contenuto genetico (DNA vs. RNA), ospite specifico (ad esempio, la famiglia dei fagi di Staphylococcus, la famiglia dei fagi di Pseudomonas, ecc.), il luogo in cui vivono (virus marini rispetto ad altri habitat) e il loro ciclo vitale (vedi sotto). Nel tempo, sono stati proposti nuovi formati di classificazione e abbreviazioni per questi virus furono suggerite da Fauquet e Pringle nel 2000.

Come parassita intracellulare obbligato di una cellula batterica, i fagi mostrano vari cicli vitali all’interno dell’ospite batterico: litico, lisogenico, pseudolisogenico e infezione cronica.

Nella terapia fagica, l’interesse principale è stato per i fagi litici, rappresentati principalmente in tre famiglie dell’ordine Caudovirales: i Myoviridae, i Siphoviridae e i Podoviridae. Ci sono anche alcune segnalazioni di applicazioni di fagi cubici e fagi filamentosi. La descrizione generale di questi fagi può essere riassunta come segue: il materiale genetico è contenuto all’interno di un guscio proteico o capside, che ha la forma di un icosaedro; questa testa è collegata tramite un collare alla coda, che può essere o meno contrattile, e la cui estremità distale è a contatto con fibre caudali le cui punte riconoscono siti di attacco sui recettori della superficie della parete cellulare batterica.

Indipendentemente dal tipo di ciclo vitale del fago, il primo passo è il legame ai recettori sulla parete cellulare batterica prima che i fagi possano penetrare nei batteri. Questo processo specifico influenza lo spettro delle possibili interazioni tra fagi e batteri. Ad esempio, il batteriofago λ interagisce solo con il recettore LamB di E. coli. Le dinamiche spaziotemporali hanno dimostrato che questo evento è di grande importanza per una riuscita invasione batterica. Alcuni fagi sono anche in grado di sintetizzare enzimi specifici (come idrolasi o polisaccaridasi e polisaccaride liasi) che possono degradare la struttura delle capsule di esopolisaccaridi prima di poter interagire con il loro

recettore specifico. Questo è il caso di alcuni fagi che interagiscono con ceppi di E. coli, V. cholerae, P. aeruginosa, E. agglomerans e P. putida. Questi enzimi sono di potenziale interesse per le loro implicazioni terapeutiche e sono attualmente in fase di sviluppo preclinico.

 

Al momento del legame al suo recettore specifico, i fagi inducono un poro nella parete cellulare batterica e iniettano il loro DNA nella cellula, mentre il capside virale rimane all’esterno dei batteri. Questo è seguito dall’espressione dei geni precoci del fago, che, nel caso dei fagi litici, reindirizzano il macchinario sintetico batterico verso la riproduzione di acidi nucleici e proteine virali. Si osservano quindi l’assemblaggio e il confezionamento dei fagi prima che si verifichino la lisi delle cellule batteriche e il rilascio della progenie fagica. Gli enzimi tardivi dei fagi, come lisine, oline e inibitori della sintesi della mureina, vengono quindi utilizzati per l’esplosione del virione nell’ambiente extracellulare. Il numero di particelle virali rilasciate o la dimensione delle esplosioni varia notevolmente a seconda del fago, dello stato dell’ospite batterico e di altri fattori ambientali, come i componenti nutritivi che circondano l’ospite.

Nel ciclo lisogenico, i cosiddetti fagi temperati inseriscono il loro contenuto genetico (il profago) nei cromosomi batterici, dove rimangono dormienti per periodi prolungati e vengono replicati come parte del cromosoma batterico. Pertanto, non c’è autoreplicazione. Questo DNA del profago viene trasmesso verticalmente insieme all’intero genoma batterico alla sua progenie fino a quando non viene indotto il ciclo litico.

Durante l’induzione, il fago lisogenico può occasionalmente trasferire materiale genetico dell’ospite adiacente al suo sito di inserimento sul cromosoma da un batterio all’altro, un fenomeno noto come trasduzione. Infatti, il ruolo significativo dei fagi nell’evoluzione del genoma batterico è noto da anni, e Brussow ha persino descritto i batteriofagi come un mezzo per il trasferimento genico laterale.

Questo processo può promuovere il trasferimento di geni che sono di vantaggio selettivo per l’ospite batterico, inclusi i geni di resistenza agli antibiotici; tuttavia, lo stesso processo potrebbe essere sfruttato terapeuticamente utilizzando i fagi per trasferire geni che rendono i batteri più suscettibili ad alcuni antibiotici. Infatti, Lu e Collins hanno dimostrato in vitro un’aumentata sensibilità di E. coli agli antibiotici prendendo di mira i meccanismi di riparazione del DNA attraverso l’iniezione di un gene specifico che ha portato alla sovraespressione di una proteina che inibisce questo sistema. L’inserimento del gene è stato ottenuto da un batteriofago M13 specifico e modificato. Interessante notare che hanno anche utilizzato la stessa tecnica in topi infettati per via intraperitoneale con E. coli. La sopravvivenza è aumentata nei topi trattati contemporaneamente con antibiotici e fagi modificati. Questo approccio è stato trovato da altri autori simile all’approccio generale della terapia fagica, che porta all’uccisione diretta dei batteri.

 

Un altro approccio consiste nell’invertire la resistenza ai patogeni iniettando geni specifici per una cassetta di sensibilizzazione che conferisce in modo dominante la suscettibilità. Questo è stato recentemente dimostrato da Edgar e colleghi, che sono stati in grado di rendere i batteri resistenti suscettibili alla streptomicina e all’acido nalidixico.

Infine, l’infezione cronica si verifica quando il batterio è infettato da fagi lisogenici che successivamente mutano e perdono la capacità di innescare un ciclo di replicazione litica. Il DNA del fago diventa una nuova parte del cromosoma batterico e diventa una sequenza di profago a lungo termine.

 

Perché abbiamo bisogno della terapia fagica?

Negli ultimi due o tre decenni, l’emergere diffuso e la diffusione di batteri resistenti agli antibiotici in tutto il mondo sono diventati una sfida terapeutica importante.

Ad esempio, le infezioni da MRSA negli USA sono state segnalate con un’incidenza di circa 100.000 infezioni gravi nel 2005, portando a 20.000 decessi.

Le opzioni terapeutiche limitate per il trattamento dei batteri multiresistenti (MDR) più importanti, noti con l’acronimo patogeni ESKAPE (per Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa ed Enterobacter spp.), sono ora diventate una crisi sanitaria incombente in molte unità di terapia intensiva in tutto il mondo.

È stato dimostrato da Morales et al. che il trattamento di pazienti con patogeni MDR aumenta il costo complessivo delle cure e prolunga i ricoveri ospedalieri.

In tutte le professioni sanitarie, c’è un imperativo etico di fare tutto il possibile per preservare l’efficacia degli antibiotici e di riconoscere che questa preziosa risorsa viene sprecata attraverso l’uso spesso non necessario e inappropriato di antibiotici, promuovendo così l’acquisizione e la diffusione di geni di resistenza agli antibiotici. La resistenza agli antibiotici è ora considerata un’emergenza sanitaria, e molti chiedono lo sviluppo di nuovi mezzi per combatterla. Tuttavia, gli antibiotici non vengono sviluppati in base al beneficio pubblico diretto, ma in base a criteri di libero mercato. Nonostante le richieste di sviluppo di nuovi antibiotici nell’Unione Europea (UE) e negli Stati Uniti (USA),

la dichiarazione della World Medical Association sulla resistenza antimicrobica (www.wma.net/e/policy/a19htm) indica una mancanza di nuovi antibiotici nella pipeline di sviluppo.

È certamente necessario un approccio completamente nuovo, non antibiotico, per il trattamento dei patogeni batterici. La riapplicazione della terapia fagica potrebbe essere un’alternativa gradita alla chemioterapia antimicrobica in questa fase di diffusione progressiva di patogeni batterici MDR con una mancanza di nuovi antibiotici per combattere questi patogeni.

Inoltre, la necessità di applicazioni fagiche supera certamente il loro uso nelle infezioni umane. Infatti, l’uso dei batteriofagi è stato descritto in varie situazioni, tra cui (ma non solo): sicurezza alimentare,

applicazioni veterinarie e applicazioni diagnostiche cliniche come il rilevamento e la tipizzazione di batteri nelle infezioni umane.

 

Potenziali benefici della terapia fagica

I batteriofagi sono antibiotici naturali in grado di regolare le popolazioni batteriche inducendo la lisi batterica. Sono attivi contro i batteri gram-positivi così come contro i batteri gram-negativi.

Poiché il meccanismo d’azione della lisi fagica è completamente diverso da quello degli antibiotici, l’attività contro i batteri che mostrano molteplici meccanismi di resistenza agli antibiotici viene mantenuta.

A causa della loro specificità, la terapia fagica ha uno spettro antibatterico ristretto con un effetto limitato a una singola specie o, in alcuni casi, a un singolo ceppo all’interno di una specie. Questo limita la “pressione” e i gravi danni collaterali che si verificano ai batteri non bersaglio circostanti dagli antibiotici. L’intero microbioma del paziente viene alterato dagli antibiotici, non solo il patogeno bersaglio previsto. Chibani-Chennoufi et al. hanno mostrato solo effetti minori sul microbiota intestinale nei topi dopo la somministrazione orale di terapia fagica mirata a E. coli. La conservazione di gran parte del microbioma esistente durante la terapia fagica è stata confermata in attente indagini microbiche su volontari adulti sani che hanno ricevuto un cocktail di 9 fagi.

La terapia fagica evita anche la potenziale crescita eccessiva di patogeni secondari.

Poiché attualmente non ci sono grandi studi randomizzati e controllati, è difficile valutare gli effetti collaterali e il loro potenziale impatto. Sulla base dei rapporti dalla Polonia e dall’ex Unione Sovietica, la terapia fagica sembra essere priva di effetti avversi significativi. Il fatto che i batteriofagi interagiscano solo con le cellule batteriche e non interferiscano con le cellule dei mammiferi potrebbe potenzialmente spiegare la mancanza di effetti collaterali dannosi. La sottonotifica potrebbe essere un’altra spiegazione. Tuttavia, l’eccellente tollerabilità del trattamento fagico è stata dimostrata in studi preclinici in vari modelli animali e in diversi studi osservazionali su pazienti e soggetti sani. La somministrazione sistemica porta a un’ampia distribuzione dei fagi, inclusa la capacità di attraversare la barriera emato-encefalica, consentendo l’uso di questi agenti nelle infezioni del sistema nervoso centrale.

Interessante notare che almeno alcuni fagi mostrano anche la capacità di distruggere i biofilm batterici.

La terapia fagica può influenzare la risposta infiammatoria a un’infezione. In 51 pazienti con varie infezioni suppurative a lungo termine, il rilascio di TNFα in vivo e in vitro è stato attenuato dopo la stimolazione con LPS, in base al pattern iniziale dei livelli sierici di TNFα. Il rilascio di IL-6 è stato significativamente ridotto solo in vivo. La proteina C-reattiva e il conteggio dei leucociti erano inizialmente inalterati in questa popolazione di pazienti, mentre sono diminuiti significativamente tra il giorno 9 e il giorno 32 in 37 pazienti che ricevevano terapia fagica orale per osteomielite, infezione da protesi articolare, infezioni della pelle e dei tessuti molli e, in un caso, infezione polmonare.

Questo era uno studio osservazionale senza un gruppo di controllo e dovrebbe quindi essere interpretato con cautela. In un’osservazione più recente, la CRP è stata influenzata solo nei pazienti il cui livello sierico iniziale di CRP era superiore a 10 mg/dL.

Anche i globuli bianchi possono essere influenzati dalla terapia fagica: nei pazienti dopo 3 settimane e 3 mesi di terapia, sono stati osservati precursori dei neutrofili aumentati e un indice di fagocitosi diminuito per Staphylococcus aureus rispetto ai donatori sani. Recentemente, è stata pubblicata un’ampia revisione dell’alterazione delle risposte immunitarie durante la terapia fagica.

Infine, gli aspetti economici della terapia fagica sono promettenti. Nonostante il fatto che la durata del trattamento fosse significativamente prolungata, i costi della terapia fagica erano inferiori rispetto al trattamento antibiotico convenzionale, come dimostrato in 6 pazienti con varie infezioni da stafilococco, incluso lo Staphylococcus aureus resistente alla meticillina.

Soprattutto, il fatto che i batteriofagi potrebbero avere un’efficacia migliorata rispetto agli antibiotici è la più grande speranza per il futuro. Smith e colleghi hanno dimostrato per la prima volta questo risultato all’inizio degli anni ’80 quando hanno indotto un’infezione letale da E. coli nei topi con un ceppo altamente virulento che esprime una capsula polisaccaridica K1.

Una singola dose intramuscolare di fagi anti-K1 è stata efficace quanto molteplici iniezioni di streptomicina e superiore a molteplici dosi intramuscolari di tetraciclina, ampicillina, cloramfenicolo o trimetoprim nel curare gli animali. A nostra conoscenza, questa osservazione non è mai stata confermata nelle infezioni umane.

 

Potenziali limitazioni e svantaggi della terapia fagica

Nonostante tutti i vantaggi riassunti sopra, siamo lontani dal chiamare i fagi una “cura miracolosa” per il trattamento di qualsiasi tipo di infezione. Infatti, la dose ottimale, la via di somministrazione, la frequenza e la durata del trattamento devono ancora essere determinate prima che vengano considerati studi clinici diffusi.

Il principale svantaggio della terapia fagica è la necessità di determinare rapidamente e accuratamente l’esatto microrganismo eziologico che causa l’infezione. La squisita specificità della terapia fagica contro patogeni specifici è un grande vantaggio, ma anche un onere. Un campione clinico deve essere isolato e coltivato utilizzando procedure diagnostiche microbiologiche standard per identificare il patogeno prima che possa essere definita una soluzione batteriofagica specifica e successivamente somministrata al paziente. Le innovazioni nella diagnosi batterica rapida utilizzando metodi genomici o spettrometria di massa potrebbero fornire una soluzione. Tuttavia, nella maggior parte dei laboratori di microbiologia clinica e nelle strutture sanitarie con risorse limitate, questo è un processo che richiede tempo.

Questo problema potrebbe essere potenzialmente risolto utilizzando cocktail di fagi pronti all’uso. La selezione di fagi potenti da una collezione disponibile dopo la tipizzazione fagica dei batteri isolati definisce il cosiddetto trattamento con cocktail di fagi composti. Infine, se non è disponibile alcuna preparazione fagica esistente attiva contro un patogeno grave, può essere isolata direttamente dall’ambiente prima di essere preparata per l’applicazione.

Ad esempio, durante il recente focolaio di E. coli O104:H4 in Germania, fagi litici attivi sono stati trovati nella collezione dell’Istituto Eliava (Georgia) così come nelle acque reflue dell’Ospedale Militare di Bruxelles in Belgio.

La scelta del batteriofago per la terapia è limitata ai fagi litici.

Infatti, i fagi lisogenici inducono una lisi ritardata, che impedisce l’uso di questi fagi in un’infezione acuta. Sebbene esistano metodi standardizzati per generare cocktail di fagi, non ci sono linee guida ufficiali chiare.

La stabilità dei virus per quanto riguarda la loro suscettibilità a vari fattori esterni e fisici è stata recentemente rivista e potrebbe essere responsabile di alcune difficoltà nella produzione di soluzioni stabili.

Un’altra preoccupazione della terapia fagica è la potenziale capacità dei batteriofagi di trasferire DNA da un batterio all’altro. Questo trasferimento di materiale genetico, o trasduzione, potrebbe essere responsabile del trasferimento di determinanti di patogenicità e fattori di virulenza, che potrebbero portare allo sviluppo di un nuovo microbo o di batteri ancora più resistenti.

Pertanto, sarebbe preferibile l’uso di fagi incapaci di impacchettare DNA ospite aggiuntivo, o di fagi che utilizzano il DNA ospite per sintetizzare il proprio DNA. Questa tecnica è già stata utilizzata con successo nella terapia fagica.

Il genoma di molti fagi è stato decifrato e ogni mese ci sono segnalazioni di sequenze geniche di nuova identificazione. Tuttavia, siamo lontani dal conoscere il gene di ogni tipo di fago e la funzione di molti di questi geni è ancora sconosciuta. Ad esempio, i geni ORFan trovati in alcuni fagi non hanno alcuna somiglianza con altri geni nel database genico. Il ruolo di questi geni nel promuovere effetti collaterali dannosi deve ancora essere chiarito.

Al termine della loro azione antibatterica, i fagi litici inducono la lisi dei batteri e rilasciano varie sostanze batteriche come l’endotossina (LPS) dai batteri gram-negativi. Questo può essere responsabile di vari effetti collaterali sull’ospite, come lo sviluppo di una cascata infiammatoria che porta a insufficienza multiorgano. Tuttavia, questo potenziale problema riguarda anche gli antibiotici battericidi rapidi attualmente disponibili.

Essendo virus, i batteriofagi possono essere considerati dal sistema immunitario del paziente come potenziali invasori e quindi rapidamente eliminati dalla circolazione sistemica dal sistema reticoloendoteliale prima che possano accumularsi nella milza o nel fegato, oppure possono essere inattivati dai meccanismi di difesa immunitaria adattativa. Ciò può portare a una ridotta efficacia con un uso prolungato o ripetuto.

Infine, lo sviluppo di meccanismi di resistenza da parte dell’ospite batterico, indotto sia da mutazione e selezione sia dall’acquisizione di fagi temperati, potrebbe portare a una ridotta efficacia dei fagi. Esistono almeno 4 meccanismi che possono essere coinvolti nella resistenza batterica a un fago specifico. La perdita o la mancanza del recettore, la modificazione strutturale e/o la mascheratura del recettore impediscono l’adsorbimento del fago ai batteri e la successiva capacità di produrre nuovi fagi. La perdita del recettore può verificarsi quando la composizione della superficie cellulare viene modificata, come è stato dimostrato per Bordetella spp.

Una modificazione strutturale è stata riscontrata per la proteina TraT di E. coli, che modifica la conformazione di OmpA (Outer-Membrane Protein A), il recettore per i fagi T-Even-like. La secrezione di varie molecole (come l’esopolisaccaride da Pseudomonas spp. o i glicoconiugati da Enterobacteriaceae) può mascherare il recettore, ma i fagi possono contrastare questo selezionando un nuovo recettore o secernendo l’enzima che degrada l’esopolisaccaride.

Gli altri meccanismi di resistenza includono la prevenzione dell’integrazione del DNA fagico da parte del sistema di esclusione della superinfezione (Sie), la degradazione del DNA fagico da parte del sistema di difesa Restrizione-Modificazione o da parte delle ripetizioni palindromiche brevi raggruppate e regolarmente interspaziate (CRISPR), e il blocco della replicazione e trascrizione fagica, della traduzione o dell’assemblaggio del virione da parte del sistema di infezione abortiva.

Fortunatamente, la frequenza di resistenza in vivo durante la terapia fagica è stata finora riportata come bassa, in contrasto con le analisi di resistenza in vitro osservate. Inoltre, l’isolamento di nuovi fagi attivi dall’ambiente o l’isolamento progressivo di fagi “adattati” potrebbe offrire una nuova opzione di trattamento.

Nella maggior parte dei paesi, la terapia fagica non è coperta dall’assicurazione sanitaria obbligatoria, il che rappresenta un potenziale problema finanziario per alcuni pazienti. Ci sono alcune eccezioni. Le autorità svizzere hanno deciso di rimborsare i costi della medicina complementare per un periodo di 6 anni mentre l’efficacia viene valutata, e il Presidente della città di Breslavia (dove si trova l’Istituto Hirszfeld), in Polonia, ha creato un programma per coprire i costi della terapia fagica per i residenti della città; 2 esempi da seguire secondo Myedzybrodzki.

Poiché i virus batterici non sono attualmente riconosciuti come prodotti medicinali, le attuali normative farmacologiche, definizioni e standard in Europa non sono adeguatamente adattati ai preparati fagici. Per questo motivo, un gruppo di ricerca belga e alcuni membri dell’Istituto Pasteur di Parigi hanno sviluppato PHAGE (Phages for Human Application Group Europe), un’organizzazione internazionale senza scopo di lucro, con l’obiettivo di sviluppare un quadro specifico per l’uso dei batteriofagi.

L’approvazione normativa rimane un altro ostacolo. Oltre alle preoccupazioni sulla sicurezza, né la Food and Drug Administration (FDA) statunitense né l’Agenzia europea per i medicinali hanno un processo di approvazione che possa facilmente accogliere le combinazioni di fagi in costante cambiamento che le aziende devono sviluppare per rimanere all’avanguardia nello sviluppo di batteri MDR.

Dati sperimentali con la terapia fagica

Molti dati sperimentali sono stati generati dalle due studi seminali di Smith e Huggins, che hanno dimostrato il potenziale ruolo dei batteriofagi nel combattere infezioni sistemiche ed enteriti in topi, vitelli, suinetti e agnelli all’inizio degli anni ’80.

I topi sono stati ampiamente studiati come animali sperimentali, ma ci sono anche segnalazioni di terapie fagiche in modelli di laboratorio di infezioni in ratti, polli, conigli, vitelli e agnelli. Sono stati valutati vari modelli di infezioni, come l’iniezione intraperitoneale di batteri vivi che porta a infezione sistemica con batteriemia, l’iniezione intramuscolare di batteri, l’infezione del sistema nervoso centrale, l’infezione polmonare, gli ascessi epatici, l’enterite, l’infezione del tratto urinario, l’infezione ossea, le infezioni della pelle e delle ferite. I batteri utilizzati in questi modelli includevano E. coli, batteri MDR (Pseudomonas aeruginosa, E. coli e K. pneumoniae produttori di ESBL, Enterococcus faecium resistente alla vancomicina), Staphylococcus aureus e Chronobacter turicensis. Alcuni ceppi sono stati isolati direttamente dai pazienti. Le procedure di somministrazione testate per la terapia fagica includono iniezione intraperitoneale, somministrazione orale o intragastrica, iniezioni topiche, sottocutanee e intramuscolari e somministrazione intranasale. Mentre in alcuni studi la somministrazione di fagi è stata considerata una misura profilattica, il trattamento è stato solitamente somministrato come dose singola dopo la sfida batterica e in alcuni studi è stato ritardato fino a quando gli animali non hanno mostrato sintomi di infezione diarroica o chiari segni di infezione grave.

Nel complesso, questi studi hanno mostrato effetti positivi sulla mortalità sotto terapia fagica, e in 3 studi in cui è stata valutata la mortalità, i risultati sono stati significativamente migliori rispetto agli antibiotici usati come agenti comparativi.

In uno studio sul modello di osso infetto nei ratti, il trattamento combinato antibiotico-batteriofago ha ridotto significativamente la coltura quantitativa dal sito infetto alla fine dello studio rispetto a ciascuna modalità di trattamento somministrata da sola.

Applicazioni umane già descritte

Nel primo rapporto sull’uso dei batteriofagi nell’uomo, l’efficacia è stata dimostrata nei foruncoli cutanei stafilococcici, e d’Herelle ha riassunto tutto il suo lavoro clinico nel 1931. Negli anni ’30, ci fu un gran numero di pubblicazioni e una monografia completa della rivista La Médicine trattò le applicazioni dei fagi nelle malattie umane. Fu descritto il trattamento di tifo, Shigella e Salmonella spp.-colite correlata, peritonite, infezioni cutanee, infezioni chirurgiche (principalmente ascessi di varie localizzazioni), setticemia, infezioni del tratto urinario e infezioni otorinolaringoiatriche (otiti esterne e foruncoli nasali).

Come descritto in precedenza, l’entusiasmo per la terapia fagica nei paesi occidentali diminuì negli anni ’30 a causa dei rapporti di Eaton e colleghi e anche come conseguenza della scoperta e della facilità d’uso degli antibiotici. L’uso dei batteriofagi continuò nei paesi orientali e, nel tempo, furono pubblicati numerosi rapporti, principalmente in Polonia e Georgia (ex URSS). L’uso di letteratura non inglese (principalmente russa e polacca) spiega probabilmente il fatto che questi rapporti fossero limitati ai paesi d’origine degli autori. Un riassunto di questa letteratura è stato recentemente pubblicato da vari autori. Tuttavia, dobbiamo notare che la maggior parte dei dati pubblicati proviene da studi non randomizzati e non controllati.

Infatti, il primo studio randomizzato controllato di Fase I condotto negli Stati Uniti è stato pubblicato nel 2009. Ha valutato la sicurezza di un cocktail di fagi diretti contro E. coli, S. aureus e Pseudomonas aeruginosa in 42 pazienti con ulcere venose croniche alle gambe. Lo studio non ha potuto dimostrare esiti positivi come il tasso di guarigione o la frequenza; tuttavia, gli autori non hanno riscontrato effetti avversi correlati al trattamento. Un altro studio randomizzato è stato condotto nel Regno Unito e ha esaminato l’efficacia dell’applicazione di una soluzione contenente 6 batteriofagi nelle orecchie di pazienti con otite cronica correlata a Pseudomonas aeruginosa. Il numero di colonie di P. aeruginosa nel gruppo trattato in questo studio ben condotto, in doppio cieco, controllato con placebo, è diminuito significativamente, mentre vari indicatori clinici soggettivi sono migliorati in questi pazienti. Infatti, i pazienti hanno riportato una ridotta intensità di sintomi come disagio, prurito, umidità e odore sgradevole. Allo stesso modo, i medici responsabili dei pazienti (e in cieco rispetto al trattamento assegnato) hanno riportato una riduzione delle osservazioni cliniche come eritema/infiammazione, ulcerazione/granulazione/polipi e odori. Non sono stati riportati effetti avversi.

Recentemente, è stato condotto un piccolo studio di Fase I con 9 pazienti trattati presso il Burn Wound Center dell’Ospedale Militare Regina Astrid a Bruxelles, in Belgio. I pazienti sono stati trattati localmente con il cocktail di fagi BFC-1, che conteneva 3 fagi litici: un miovirus, un podovirus diretto contro Pseudomonas aeruginosa e un miovirus diretto contro Staphylococcus aureus. Una grande sezione ustionata è stata esposta a una singola applicazione spray, mentre una parte distante della ferita è servita da controllo. Sebbene i risultati completi debbano ancora essere pubblicati, non sono stati segnalati problemi di sicurezza.

Infine, uno studio randomizzato controllato ha confermato la sicurezza di una soluzione fagica somministrata per via orale in pazienti sani e non infetti.

Conclusioni

I batteriofagi sono un potenziale strumento alternativo per trattare le infezioni batteriche, comprese quelle causate da patogeni MDR. Infatti, la terapia fagica presenta diversi vantaggi e sono riportati solo pochi eventi avversi, anche se non si può escludere una sottosegnalazione. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi ben condotti per definire il ruolo e la sicurezza della terapia fagica nella pratica clinica quotidiana per il trattamento di pazienti con diverse infezioni.

Inoltre, l’uso diretto di proteine codificate dai fagi, come endolisine, exopolisaccaridasi e holine, si è dimostrato una promettente alternativa ai prodotti antibatterici. Tuttavia, questo argomento esula dall’ambito di questa revisione.

 

Traduzione automatica della fonte: https://doi.org/10.4161/viru.25991

Xavier Wittebole, Sophie De Roock & Steven M Opal